茉莉酸甲酯对肝癌的抑制作用及其机理研究

【摘要】前言肝细胞性肝癌在我国的发病率明显高于西方国家,其恶性程度和死亡率都非常高,是严重威胁我国人民生命健康的疾病。全世界每年新增的肝癌病例,我国占到一半左右。目前肝癌治疗仍然以外科切除为主,但是治疗率低、复发性高、预后差,且由于肝癌被确诊时大多已处于晚期失去了手术的最佳时期。因此,研究和应用有效的、可耐受的治疗肝癌的新药仍然是我国肝癌防治工作的重中之重。由于信号调控机制异常而导致肝癌细胞能“逃避”细胞凋亡,肝癌细胞强大的迁移和侵袭能力,以及对抗癌药物极易产生耐药性,是肝癌难以治愈的原因。从天然动植物中寻找低毒、高效的抗癌活性成分是近年来研究的热点之一。茉莉酸类是从茉莉中分离出来的一种类似于植物应激激素的水杨酸。有研究表明茉莉酸甲酯能治疗皮肤真菌感染、具有抗肿瘤作用及抗血管生成作用。研究证明茉莉酸甲酯可以抑制胃癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与清除自由基,影响细胞周期蛋白(Cyclin)及细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependenikinase,CDK),影响P53、Bcl-2家族、caspase活性,影响与肿瘤发生密切相关的细胞信号传导通路等。本研究通过三个方面对茉莉酸甲酯的抗癌活性及其可能机制进行了探讨。第一,研究了茉莉酸甲酯对HepG2、PLC/PRF/5和Hep3B等六种肝癌细胞株生长增殖的影响,选择抑制作用最强的HepG2作为其茉莉酸甲酯抗癌作用机制研究的对象；第二,探讨了茉莉酸甲酯对肝癌细胞迁移和血管生成能力的影响；第三,探讨了茉莉酸甲酯对肝癌顺铂化疗敏感性的影响及机制。1茉莉酸甲酯通过AMPK和mTOR信号通路对肝癌细胞抑制作用的研究目的：观察茉莉酸甲酯对肝癌细胞的抑制作用,以及对细胞内AMPK和mTOR信号通路的影响,探索茉莉酸甲酯抑制肝癌细胞生长增殖的机制。方法：SRB实验检测不同浓度茉莉酸甲酯对HepG2、PLC/PRF/5.Hep3B、HepG2.2.15、Mahlavu、SK-Hep1等肝癌细胞株生长增殖的影响。流式细胞术检测细胞周期和线粒体膜电位变化,RT-PCR和Westernblot分别检测细胞内AMPK和：uTOR信号通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达。电镜下观察茉莉酸甲酯干预对细胞形态变化的影响。免疫沉淀法检测茉莉酸甲酯对HepG2细胞TSC2/TSC1复合物组装情况。结果：茉莉酸甲酯的抗癌效能次序是HepG2>HepG2.2.15>Mahlavu>PLC/PRF/5>SK-Hep1>Hep3B。HepG2细胞采用双胸腺嘧啶阻断同步后,茉莉酸甲酯彻底阻止了细胞周期进程,并随后诱导细胞凋亡。包括细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、Cdk2和Cdk2在内的G1调节蛋白核移位减少和下调支持了这一结论。茉莉酸甲酯没有改变G1调节蛋白的mRNA表达水平,表明蛋白翻译受到抑制,但转录水平没收到影响。茉莉酸甲酯诱导组装TSC1/TSC2,并通过抑制包括mTOR(Ser2448),p70S6K(Thr421/Ser424和Thr389)和4E-BP1(Thr37/Thr46和Thr70、)等蛋白质磷酸化导致细胞蛋白质合成受阻。此外,茉莉酸甲酯干预引起肝癌细胞AMPK活性升高。AMPK抑制剂复合物C显著逆转茉莉酸甲酯干预效果的结果表明。AMPK通路是茉莉酸甲酯抑制肝癌细胞增殖过程中的关键途径。此外,线粒体膜电位和线粒体含量下降表明茉莉酸甲酯引起线粒体氧化应激。结论：茉莉酸甲酯干预HepG2细胞后,引起线粒体应激反应,激活AMPK信号通路,导致线粒体膜电位下降和TSC1/TSC2复合物形成增加。最终,mTOR介导的蛋白质翻译通路受阻,肝癌HepG2细胞G1阻滞,引起HepG2细胞死亡。2茉莉酸甲酯对肝癌细胞迁移和血管生成能力的影响目的：探讨茉莉酸甲酯对肝癌HepG2细胞侵袭及血管生成的影响方法：蛋白质印迹分析茉莉酸甲酯对HepG2细胞pERK1/2.pJNK1/2、p-p38、RhoB、NF-κβ、IκB、组蛋白等表达的影响。划痕愈合实验检测茉莉酸甲酯对肝癌细胞迁移能力的影响。半定量RT-PCR和荧光实时定量PCR检测茉莉酸甲酯对肝癌细胞MMPs/TIMPs、RhoB和血管内皮生长因子-A表达的影响。双荧光素酶报告基因检测系统分析茉莉酸甲酯对HepG2细胞MMP-2/9、RhoB和血管内皮生长因子启动子活性的影响。明胶酶谱检测分析茉莉酸甲酯对HepG2细胞分泌MMP-2/9活性影响。体外血管形成分析茉莉酸甲酯对人脐静脉内皮细胞体外血管形成能力的影响。结果：亚细胞毒性浓度茉莉酸甲酯抑制了佛波酯(PMA)引起的肿瘤细胞的侵袭和迁移。在对迁移/侵袭所涉及分子的分析过程中,本研究结果发现茉莉酸甲酯下调了基质金属蛋白酶的活性MMP-2/9mRNA的表达水平,降低了MMP-2/9启动子/明胶裂解能力。茉莉酸甲酯同时强烈抑制血管内皮生长因子表达、启动子活性以及抑制血管内皮细胞迁移/侵袭以及体外血管形成能力。茉莉酸甲酯抑制了NF-κB的DNA结合以及核易位。结论：茉莉酸甲酯能有效地抑制参与细胞迁移的关键调控分子在肝癌HepG2细胞中的表达,同时在mRNA和蛋白质水平上抑制MMP-2/9和RhoB的表达。此外,茉莉酸甲酯显著抑制了血管内皮生长因子-A基因表达和启动子活性。其可能的机制是茉莉酸甲酯抑制了NF-κB核易位和抑制其与DNA结合。茉莉酸甲酯还对血管生成的几个重要步骤有明显抑制作用,如内皮细胞增殖,迁移／侵袭以及体外血管形成能力。3苿莉酸甲酯增强肝癌细胞株HepG2对顺铂化疗敏感性的研究目的：探讨茉莉酸甲酯的使用与肝癌细胞株HepG2对顺铂化疗敏感性的关系。方法：裸鼠皮下接种肝癌HepG2细胞构建肝癌模型。免疫组织化学法检测Ki-67抗体、CD34抗体、VEGF、3-NT、HO-1和NQO-1在肿瘤及肝肾组织中的表达情况。TUNEL法检测细胞凋亡。酶联免疫法检测动物模型体内血清尿素氮和肌酐水平,ALT和AST含量。肝肾组织匀浆后检测MDA和SOD。MTT检测茉莉酸甲酯和或顺铂干预对HepG2细胞增殖的影响。流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹检测HO-1和NQO-1的表达情况。结果：喂服茉莉酸甲酯能显着抑制肿瘤的生长,并提高顺铂对接种HepG2肝癌细胞小鼠的抗癌疗效。此外,喂服茉莉酸甲酯可显著抑制顺铂引起的肾毒性、肝毒性和氧化应激。在细胞实验中,茉莉酸甲酯抑制顺铂对LLC-RK1肾上皮细胞和NCTC1469肝细胞的细胞毒性作用(对HepG2肝癌细胞无作用),并显著降低顺铂诱发的细胞内ROS水平。在正常细胞中,细胞质局部分布有Nrf2、HO-1和NQO-1水平微弱,茉莉酸甲酯能大幅抑制顺铂引起的HO-1/NQO-1水平,抑制顺铂诱导的Nrf2转入细胞核。细胞质中]3O-1/NQO-1及细胞核中Nrf2高表达的具有化疗抗性的癌细胞中,茉莉酸甲酯干预可以降低其表达水平,从而提高癌细胞对顺铂敏感性。结论：茉莉酸甲酯具有抗癌活性,能提高顺铂治疗效果并保护肝脏和肾脏免受顺铂导致的组织损伤,茉莉酸甲酯通过清除ROS并降低Nrf2介导的HO-1/NQO-1表达发挥对肝肾组织的保护作用,其可能机制是正常细胞和肿瘤细胞中HO-1/NQO-1表达差异和Nrf2定位差异有关。
【作者】汪长发；
【导师】蒋先镇；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】茉莉酸甲酯；肝癌；腺苷酸活化蛋白激酶；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；G1期阻滞；迁移；血管生成；金属基质蛋白酶；顺铂；自由基清除；NF-E2相关因子；血红素氧化酶-1；NAD(P)H醌氧化还原酶-1；

【参考文献】
[1]罗姗姗,彭鹏,毛亚胜,金乃正,沈水明.基于光纤通信的多端线路电流差动保护装置[J].电力系统自动化,2006,09:50-55.
[2]张青青.赞助人系统之操纵与反操纵[D].西南大学,英语语言文学,2013,硕士.
[3]焦磊涛.基于气动肌肉驱动的仿蛙腿跳跃机构控制系统研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[4]徐叶强.基于情感分类的产品评论垂直搜索引擎的研究[D].湖南工业大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[5]刘畅.中国城市街道办事处改革的思考[D].吉林大学,公共管理,2014,硕士.
[6]闫清波,胜献雷,郑庆荣,苏刚.硼富勒烯及其相关结构研究进展[J].中国科学:物理学力学天文学,2011,01:29-48.
[7]邹左军,刘希.多级自寻最优控制在城市交通控制中的应用[J].自动化学报,1986,04:406-409.
[8]刘继仁.具裂纹预应力混凝土梁的有限元分析[D].湖南大学,工程力学,2011,硕士.
[9]刘伟.基于间十五烷基酚聚酯型超分散剂研究[D].郑州大学,化学工艺,2014,博士.
[10]武晓梅.论我国刑事拘留中的人权保障[D].海南大学,诉讼法学,2013,硕士.
[11]胡海涛,李允超,王贤华,张帅,杨海平,陈汉平.生物质预处理技术及其对热解产物的影响综述[J].生物质化学工程,2014,01:44-50.
[12]张聪跃.光纤寄生偏振耦合白光干涉仪光学系统设计[D].天津大学,光学工程,2004,硕士.
[13]张晶.基于效用理论的灾后配电网多故障抢修实时调整策略研究[D].燕山大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[14]马淳安,邱志军,颜飞,赵峰鸣,徐颖华,褚有群.离子色谱法测定丁二酸合成电解液中马来酸和丁二酸[J].理化检验(化学分册),2013,01:59-62.
[15]韦任良.创造黑色食品第一品牌[J].中外管理.1997(05)
[16]王白古拉.内蒙古莫力达瓦地区曲棍球发展特征的研究[D].内蒙古师范大学,民族传统体育学,2012,硕士.
[17]李淑贤.基于Cobb-Douglas生产函数的宿迁市木材加工产业规模经济评价研究[D].南京理工大学,工业工程,2012,硕士.
[18]彭志辉,和军平,马光,周晨,李峰平.光伏发电系统MPPT输出功率采样周期的优化设计[J].中国电机工程学报,2012,34:24-29+5.
[19]盖芸瑚.HSDA-HTC的制备及其对棉织物的抗菌整理[D].苏州大学,纺织工程,2012,硕士.
[20]李国辉.长沙市生态环境分析及城市林业生态圈的规划框架[D].湖南农业大学,种植,2003,硕士.
[21]李探,赵成勇,王朝亮,庞辉,李泓志,胡静.用于电网黑启动的MMC-HVDC系统换流站启动策略[J].电力系统自动化,2013,09:117-122.
[22]杨升华.高校成绩管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[23]杨霄松.同一控制下企业合并的财务效应研究[D].河北经贸大学,会计,2014,硕士.
[24]汪兆国.当前成熟类商业医药公司投资策略中的风险控制分析[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[25]刘月明,李建勇,蔡永林,聂蒙.钢轨打磨技术现状和发展趋势[J].中国铁道科学,2014,04:29-37.
[26]孙先文.吴越钱氏政权研究[D].安徽大学,专门史,2004,硕士.
[27]樊非.新世纪新阶段中国政府文化职能转变[D].河海大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[28]许海涛.政风行风热线类节目发展研究[D].河北大学,公共管理,2014,硕士.
[29]赵枝凯.机器人辅助远程骨科手术时延控制研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[30]樊会星.液压驱动双足机器人的运动控制与步态规划[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[31]周子秋.论投资条约中利益否决条款的适用[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[32]蒋玲慧.孔系柔性夹具定位误差及自动夹紧方案规划的研究[D].江苏科技大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[33]侯银银.闲暇环境教育与生态旅游耦合度评价研究[D].中南林业科技大学,森林游憩与公园管理,2014,硕士.
[34]李翠含.民间儿童游戏跳皮筋的游戏仪式与文化表达[D].北京体育大学,民族传统体育,2013,硕士.
[35]朱瑜.环境侵权第三人责任问题研究[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[36]王一多.我国期货市场期权式交易策略研究[D].北方工业大学,数量经济学,2014,硕士.
[37]王亚刚,邵惠鹤.基于幅值裕度和相位裕度的自整定PID控制器[J].控制与决策,2000,05:589-591.
[38]申园园.超声辅助-纳米零价铁/过氧化氢降解离子液体[D].河南科技大学,化学工艺,2013,硕士.
[39]罗震峰.冷冻干燥法制备Al_2O_3多孔陶瓷工艺及成孔机理研究[D].陕西理工学院,材料加工工程,2013,硕士.
[40]刘萨.章学诚学之有限性研究[D].华东师范大学,中国哲学,2013,硕士.
[41]杨秋.元代文言小说研究[D].西南大学,中国古代文学,2013,硕士.
[42]段斌华.广州开发区决策支持信息系统建设[J].广东科技,2003,04:41-43.
[43]蒋东杰.小型零件回转立体库系统设计与分析[D].内蒙古工业大学,机械工程,2013,硕士.
[44]黄铭.大学生心理健康教育网络模式的构建[D].重庆交通大学,思想政治教育,2011,硕士.
[45]崔健.图式理论在高中英语阅读教学中的实证研究[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[46]杨光.大剂量甲氨蝶呤在骨肉瘤患者中的群体药动学研究[D].吉林大学,临床医学（专业学位）,2014,硕士.
[47]胡蘅芬.氧化苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞HGC-1表达的影响及调控机制研究[D].南华大学,内科学,2012,硕士.
[48]梁敏君.北仑国家级全民健身示范区的结构特征研究[D].宁波大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[49]司小胜,胡昌华,周东华.带测量误差的非线性退化过程建模与剩余寿命估计[J].自动化学报,2013,05:530-541.
[50]于建国,韩文功,于正军,路慎强,王金铎.济阳拗陷孔店组烃源岩的地震预测方法[J].石油地球物理勘探,2005,03:318-321+338-18+372.