miR-148a调控破骨细胞分化及其在SLE患者骨量异常中的作用机制

【摘要】第一部分初发系统性红斑狼疮(SLE)患者破骨前体细胞hsa-miR-148a表达水平和意义目的：分离纯化初发SLE患者和正常对照组的CD14+外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells,PBMCs),研究SLE患者CD14+PBMCshsa-miR-148a表达改变。探讨hsa-miR-148a表达与初发SLE患者骨量异常的关系。方法：招募相互匹配的31例中国青年女性,其中16人为未接受过糖皮质激素治疗的初发SLE患者,15例为正常对照组。用密度梯度离心法分离两组人群的外周血单核细胞,然后用免疫磁珠法分选高纯度的CD14+PBMCs,并通过实时定量PCR(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)法检测hsa-miR-148a在两组人群CD14+PBMCs中的表达情况。在上述两组人群的CD14+PBMCs使用重组人巨噬细胞集落刺激因子(recombinanthuman-macrophagecolonystimulatingfactor,rh-MCSF)和人核因子κB受体活化素配体(humanreceptoractivatorofnuclearfactor-KBligand,hRANKL)诱导其向破骨细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,TRAP)染色、‘TRAP活性测定及实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/活化T细胞核因子c1(nuclearfactorofactivatedTcellsc1,NFATc1)mRNA水平观察两组破骨细胞的分化成熟情况。将anti-miR-148a转染SLE患者的CD14+PBMCs,转染后加入rh-MCSF和hRANKL诱导破骨细胞分化培养,行TRAP染色、TRAP活性测定及实时定量PCR法检测TRAP/NFATclmRNA水平观察破骨细胞的分化成熟情况。结果：(1)初发SLE患者的骨密度明显低于正常对照组,而初发SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表达水平明显高于正常对照组。(2)与正常对照组相比,SLE患者组TRAP+多核巨细胞数量增加,TRAP活性增强,TRAP/NFATc1mRNA水平升高。(3)将anti-miR-148a转染SLE患者的CD14+PBMCs,可抑制TRAP+多核巨细胞形成,TRAP活性减弱,TRAP/NFATc1mRNA水平下降。结论：初发SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表达明显升高,导致其破骨活性增强,骨量降低。第二部分mmu-miR-148a对去卵巢小鼠骨代谢的影响目的：综合骨密度检测、Micro-CT分析、骨组织形态计量学分析、成破骨相关因子mRNA表达水平检测、血清骨转换生化指标检测评价mmu-miR-148a对小鼠骨代谢的影响。方法：将36只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为6组：去卵巢(Ovariectomy,OVX)+antagomiR-148a组,OVX+PBS组,OVX+阴性对照(mut-antagomir)组,假手术(SHAM)+antagomiR-148a组,SHAM+PBS组,SHAM+阴性对照(mut-antagomir)组。去卵巢小鼠模拟绝经后状态,用mmu-miR-148a的阻滞剂antagomiR-148a实现活体内骨组织mmu-miR-148a表达受抑,观察mmu-miR-148a表达受抑对去卵巢小鼠骨代谢的影响：用双能X线骨密度仪(DXA)检测股骨颈骨矿密度(bonemineraldensity,BMD);Micro-CT分析检测胫骨近端骨小梁体积比及骨小梁厚度；骨组织形态计量学分析骨形成、骨吸收参数；实时定量PCR法检测成破骨相关因子(NFATc1,TRAP及ALP)mRNA表达水平及酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清骨转换生化标志物(TRAP及B-ALP)。结果：(1)antagomiR-148a注射后导致小鼠体内mmu-miR-148a表达明显受抑。(2)SHAM组中,mmu-miR-148a表达受抑可导致骨密度增加,骨小梁体积比及骨小梁厚度增加,骨形成及骨吸收参数均下降,成破骨相关细胞因子mRNA表达水平及血清骨转换生化标志物均明显下降。(3)与SHAM组相比,OVX组小鼠骨密度下降,骨小梁体积比及骨小梁厚度降低,骨形成及骨吸收参数均升高,成破骨相关细胞因子mRNA表达水平及血清骨转换生化标志物均明显上升。OVX小鼠中抑制mmu-miR-148a表达可纠正上述改变。结论：mmu-miR-148a表达缺失抑制骨吸收,导致骨密度增加,骨微结构改善,阻碍骨质疏松进展。第三部分mmu-miR-148a对小鼠破骨细胞分化的功能研究目的：研究mmu-miR-148a在RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中的作用。方法：用诱导剂诱导RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化,qRT-PCR法检测mmu-miR-148a在此过程中的表达模式。用pSilencer4.1-CMVpuro合成mmu-miR-148a表达载体pre-miR-148a。将miRNA前体(pre-miR-148a)转染RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞,造成mmu-miR-148a过表达细胞模型,随后加入诱导剂诱导其向破骨细胞分化,行TRAP染色观察破骨细胞分化情况,实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平。将2’-O-methyl修饰的反义寡核苷酸anti-miR-148a转染RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞,构建mmu-miR-148a表达降低细胞模型,行TRAP染色观察破骨细胞分化情况,实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平。结果：(1)应用qRT-PCR检测显示,诱导RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中,随着诱导时间的延长,mmu-miR-148a表达逐渐增多。(2)用pSilencer4.1-CMVpuro成功构建]mmu-miR-148a表达载体pre-miR-148a,用pre-miR-148a转染RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞能使细胞中mmu-miR-148a表达明显升高。(3)RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞过表达nmu-miR-148a促进TRAP+多核巨细胞形成,破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平提高。(3)RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞mmu-miR-148a表达下调则抑制TRAP+多核巨细胞形成,TRAP/NFATclmRNA水平下降。结论：mmu-miR-148a对小鼠破骨细胞分化具有正性调控作用。
【作者】陈超；
【导师】罗湘杭；
【作者基本信息】中南大学，内科学，2014，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；hsa-miR-148a；骨密度；mmu-miR-148a；去卵巢小鼠；骨代谢；过表达；分化；

【参考文献】
[1]殷峰.论市民社会与法治[D].陕西师范大学,政治学理论,2004,硕士.
[2]汪淼.城市轨道交通项目融资BT模式研究[D].北京交通大学,2008.
[3]卞葆.加快我国纺织科技经济一体化的对策[J].中国纺织.1995(04)
[4]伏凌波.园林地形高差的处理研究[D].中南林业科技大学,园林设计（专业学位）,2014,硕士.
[5]魏秋生.论我国民事诉讼审前准备程序的改革与完善[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[6]曾惜.大型水电站地下洞室群施工期通风研究[D].西南交通大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2014,硕士.
[7]肖洪波.中学化学教学中“知识问题化，问题活动化”教学模式的构建与实施研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[8]李红玉.HLA-DRB1*07、11、14等位基因对广西乙肝相关性疾病病情的影响[D].广西医科大学,传染病学,2013,硕士.
[9]陆日超.高黎贡山隧道岩爆声发射监测与数值分析[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[10]王蓝天.我国烘焙月饼的生产与保质研究[D].河南科技大学,食品加工与安全（专业学位）,2013,硕士.
[11]许雯.基于分布式蜜罐的云端安全机制研究[D].江苏科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[12]戴洁.基于嵌入式Linux的无线多媒体传输系统设计与实现[D].浙江工业大学,2008.
[13]林式藩.CIMS的组成与应用第4讲CIMS的生产管理信息系统[J].冶金自动化,1998,03:51-56.
[14]张小芳.母语为英语的留学生动宾式离合词使用偏误分析及汉语教学[D].西安外国语大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[15]刘丹.辉瑞亚太财务共享服务中心发展战略研究[D].大连理工大学,EMBA（专业学位）,2012,硕士.
[16]陈媛媛.留置不同人工气道长期机械通气患者的病因探讨及并发症的差异性分析[D].苏州大学,呼吸内科（专业学位）,2013,硕士.
[17]吕华益.MT智能建筑公司竞争战略研究[D].大连理工大学,EMBA（专业学位）,2012,硕士.
[18]郝丽伟.英国《卫报》数据新闻研究[D].河北大学,新闻与传播,2014,硕士.
[19]程学尾.中国货币替代问题研究[D].山东大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[20]王晓明.中学与大学无机化学实验教学衔接问题调查与研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[21]王清波.干电池生产线高速视觉终检系统[D].华南理工大学,仪器仪表工程,2012,硕士.
[22]杨林东.民生银行客户关系管理存在问题及对策研究[D].西安科技大学,工商管理,2014,硕士.
[23]郑军.柴北缘古元古界变质岩系地质特征及其构造属性研究[D].长安大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[24]陆成.霍乱弧菌胆盐外排相关基因筛选方法的建立及有氧生长相关蛋白Scol和C-signal的研究[D].南京农业大学,微生物学,2012,硕士.
[25]杨振先.多摄像机标定技术研究及其应用[D].湖南大学,计算机科学与技术,2011,硕士.
[26]李恒恒.抛散型气流分级机性能研究与结构优化[D].中国矿业大学,化工过程机械,2014,硕士.
[27]周会斌.基于出口竞争优势的产业内贸易模式研究[D].大连理工大学,企业管理,2004,硕士.
[28]何鹏,陶建华.基于Sobolev空间序列特征值问题的自然图像小尺度模式分析[J].自动化学报,2009,12:1568-1573.
[29]武永鑫.锂离子电池电极材料的研究[J].吉林工程技术师范学院学报,2015,05:84-86.
[30]任硕智.祭祀建筑空间序列设计研究[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[31]房胜.大规模MIMO系统的频谱效率和导频污染问题研究[D].杭州电子科技大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[32]柯刘阳.基于TCP长连接的负载均衡器设计与实现[D].电子科技大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[33]徐晓蕾.海门方言古词语词义研究[D].华中师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[34]韩耀胜男.集体建设用地使用权流转的法律规制[D].西南政法大学,民商法学（专业学位）,2012,硕士.
[35]赵贺.电力系统可视化相关问题及其在发电厂中应用的研究[D].大连理工大学,2009.
[36]袁亮.网络环境下商务智能的解决方案及应用[D].华东师范大学,2005.
[37]肖一爽.南京国民政府时期商标法制研究[D].西南政法大学,法律史,2012,硕士.
[38]赵世超.改性粉煤灰合成沸石分子筛及其吸附性能的研究[D].北京交通大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[39]崔升华.高中新课程化学必修（1）抛锚式教学的设计研究[D].广西师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[40]孙丽华.岩藻聚糖硫酸酯诱导人结肠癌细胞HT-29凋亡和自噬的研究[D].山东大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[41]商周.搜集数据进行数据挖掘的研究[D].哈尔滨理工大学,2004.
[42]孙玉宝.液晶平板显示激光背光模组的设计与实验研究[D].山东大学,光学工程,2013,硕士.
[43]陈加鹏.交变磁场水处理装置的研制与阻垢除垢的实验研究[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[44]亢海记.建国以来中国共产党党内监督问题研究[D].东北师范大学,中共党史,2012,硕士.
[45]鲁爱莲,胡中爱,胡英瑛,徐欢,李丽,杨玉英,张子瑜.还原氧化石墨烯/Al-Ni层状双氢氧化物复合物的制备及其电化学电容行为[J].化工新型材料,2012,12:100-103.
[46]李亚南.现金流来源对现金持有价值影响研究[D].新疆财经大学,会计学,2013,硕士.
[47]王洪萍.公司法定代表人更换中引发的法律问题[D].中国政法大学,比较法学,2013,硕士.
[48]陈二磊.基于嵌入式系统的轮式机器人定位技术的研究与实现[D].西安电子科技大学,检测技术及自动化装置,2012,硕士.
[49]徐星.基于WPF开发技术的胎位布局计划研究[D].江苏科技大学,船舶与海洋结构物设计制造,2014,硕士.
[50]吕亚兵,尹朝庆,吴越,王新梅.基于聚类分析的Web服务器浏览模式的挖掘方法[J].武汉理工大学学报(信息与管理工程版),2005,06:53-55+73.