miR-429通过Onecut2抑制TGF-β1诱导的结直肠癌细胞上皮—间质转化的机制研究

【摘要】[研究背景]结直肠癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤,多阶段发病和多基因参与是结直肠癌发生发展的重要病理特征。随着基因组学和转录组学研究技术的不断发展,使得人们能够从整体水平探究结直肠癌不同临床进展阶段的编码RNA和非编码RNA的动态表达规律。本课题组前期曾经采用最新全基因组芯片和microRNA芯片,构建了结直肠癌不同临床进展阶段的动态差异基因表达谱和动态miRNA差异表达谱,进而构建了microRNA-基因功能网络。从所构建的网络中发现,miR-429位于网络的核心位置,是结直肠癌发生发展过程中的重要microRNA。因此,本研究在课题组前期工作的基础上,选择miR-429进一步证实其在结直肠癌发生发展过程中的动态表达规律和其在结直肠癌中所发挥的分子生物学功能及其作用机制。[研究方法]本实验组首先采用实时荧光定量PCR的方法,检测了miR-429在结直肠癌细胞和18例结直肠癌组织以及配对的18例结直肠癌远端正常组织标本中的表达。其次收集了结直肠癌不同临床进展阶段的组织标本及病理资料,共85个临床样本(61例结直肠癌组织TNM分期I期11例,Ⅱ期18例,Ⅲ期20例,Ⅳ期12例及24例正常对照组)进行实时荧光定量PCR检测分析,证实miR-429在结直肠癌不同临床进展阶段的动态表达模式。利用103例结直肠癌组织芯片采用原位杂交的方法进一步检测了miR-429在结直肠癌不同临床进展阶段的动态表达变化。对组织芯片中103例结直肠癌患者随访统计资料,获得生存资料,经Kaplan-Meier生存分析miR-429的表达对结直肠癌预后预测的影响。并从细胞和分子水平上检测了miR-429对结直肠癌细胞EMT相关生物学行为和细胞表型的影响。构建结直肠癌皮下移植瘤模型,研究miR-429对结直肠癌皮下移植瘤的影响。在此基础上,我们通过在线软件targetscan6.1预测发现,在Onecut2基因的3’UTR区含有两个与miR-429的结合位点,深入探讨miR-429通过Onecut2对TGF-β1诱导的结直肠癌细胞上皮-间质转化的影响及其作用机制,为初步阐明miR-429在结直肠癌侵袭转移中的作用机制,也为临床抗肿瘤分子靶向治疗提供更多的理论基础。[结果]1.miR-429在结直肠癌发生发展过程中呈动态变化的表达模式,并与患者预后密切相关。通过实时荧光定量PCR和原位杂交的方法检测了miR-429在结直肠癌不同临床进展阶段的表达,发现miR-429在绝大所数结直肠癌中表达明显下调,miR-429在不同临床进展阶段的结直肠癌中的表达呈动态变化的趋势,其变化趋势与本课题组前期通过miRNA芯片获得结直肠癌的miRNA动态差异表达的模式一致。通过使用原位杂交的方法分析miR-429在103例结直肠癌中的表达与患者临床病理特征的相关性,发现miR-429在结直肠癌中的低表达与患者的年龄和肿瘤的分化程度密切相关。miR-429在结肠癌中的低表达与结直肠癌的TNM分期的Ⅱ和Ⅲ期进展密切相关,但与Ⅰ期和Ⅳ期进展无关,与患者有无淋巴结转移也无明显的相关性。另外经Kaplan-Meier生存分析发现miR-429表达和生存密切相关,miR-429低表达患者生存率要比miR-429高表达患者低,预后差。2.miR-429通过靶向Onecut2抑制了结直肠癌细胞的上皮-间质转化。首先通过体外转染过表达的miR-429检测其对结直肠癌细胞增殖抑制的能力,MTT的结果表明,miR-429在2.5pmol/L的浓度作用48-72h的抑制效果最明显。同时,我们也进行了结直肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤实验,通过瘤内多点注射miR-429mimics,观察miR-429对结直肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用,结果表明,miR-429可以明显的抑制结直肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长。该结果表明,miR-429参与了结直肠癌的发生发展,可能是结直肠癌治疗的很好的小分子作用靶点。为了进一步探索miR-429作为小分子治疗靶点的可能的分子机制,综合考虑本课题组前期的工作基础,选择并验证了Onecut2是miR-429的靶基因,miR-429可以在转录及转录后水平调控Onecut2的表达,我们的研究也证明了miR-429和Onecut2在结直肠癌组织中存在表达的负相关性。我们进一步检测了miR-429对EMT相关生物学行为的影响。我们的研究结果表明,miR-429抑制了结直肠癌SW620细胞的迁移和侵袭。同时,干扰内源性的Onecut2也能抑制SW620细胞的迁移,过表达Onecut2可以恢复miR-429介导的SW620细胞的侵袭抑制。这些均表明,miR-429可以通过靶向Onecut2的表达抑制结直肠癌SW620细胞的迁移和侵袭。miR-429可以抑制TGF-β1诱导的上皮-间质转型。3.miR-429可以逆转TGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT相关的转录因子和基因表达的改变。EMT的形成除了明显的细胞形态学特征的改变外,还伴随着一系列特征性生物分子的改变。我们的研究表明,miR-429过表达或者是干扰内源性Onecut2的表达可以逆转TGF-β1诱导的结直肠癌SW620细胞中EMT相关的转录因子和基因表达的改变。在TGF-β1诱导的前提下,miR-429过表达或者是干扰内源性Onecut2的表达增加了连环分子(E-cadherin,CTNNA1和CTNNB1)和纤维连接蛋白(FN)的表达,下降了异源性粘附分子CD44和基质蛋白酶MMP2的表达。我们的研究也表明,TGF-β1诱导了结直肠癌SW620细胞中Onecut2、ZEB1、ZEB2、SNAIL和SLUG的表达,miR-429抑制了Onecut2、ZEB1、ZEB2、SNAIL和SLUG的表达,而干扰内源性Onecut2具有与miR-429过表达一样的效用。此外,我们在结直肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤中利用免疫组化也证实了上述EMT相关的转录因子和基因表达的变化。以上结果表明,miR-429可以通过靶向作用Onecut2逆转TGF-β1诱导的结直肠癌中EMT相关的转录因子和基因表达,同时,Onecut2也可以作为EMT相关的转录因子,直接参与了结直肠癌细胞EMT的启动。[结论]1.证实了miR-429在结直肠癌发生发展过程中呈动态变化的表达模式,并与患者预后密切相关。2.证实了miR-429通过靶向Onecut2抑制了结直肠癌细胞的上皮-间质转化。3.证实了miR-429可以逆转TGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT相关的转录因子和基因表达的改变,不仅为结直肠癌的发生发展机制提供了重要的实验证据和理论依据,同时也为结直肠癌的小分子治疗靶点提供了有力的支撑。图22幅,表6个,参考文献70篇
【作者】孙英男；
【导师】沈守荣；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】miR-429；Onecut2；上皮间质化；结直肠癌；

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