高产β-甘露聚糖酶菌株选育、构建及其酶学特性研究

【摘要】向油井注入压裂液是油田增产的重要措施之一,为提高压裂效果,压裂液中常加入增稠剂(如瓜尔胶、魔芋胶等)。高黏度的压裂液在完成压裂后需要迅速破胶,在压裂液中加入生物酶破胶剂可以使增稠剂降解,以达到破胶的目的。本研究将筛选到的降解瓜尔胶高产β-甘露聚糖酶的菌株Chryseobacteriumsp.HL-28,及东北林业大学微生物实验室保存的降解魔芋胶的菌株BacillussubtilisWD23、B.subtilisK依次进行紫外诱变、甲基磺酸乙酯诱变和60Co诱变,再将获得的遗传稳定性好的诱变菌株Man基因进行克隆,并利用毕赤酵母表达系统实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,并对重组酶的酶学特性进行了研究。获得的主要结果如下：(1)降解瓜尔胶菌株的筛选和鉴定从亚麻沤麻液中筛选到一株降解瓜尔胶产p-甘露聚糖酶的菌株,结合形态学观察、生理生化特性和16srDNA序列分析,鉴定该菌株为黄杆菌科(Flavobacteriaceae)金黄杆菌属(Chryseobacterium)细菌,定名为Chryseobacteriumsp.HL-28。(2)瓜尔胶和魔芋胶降解菌的诱变育种Chryseobacteriumsp.HL-28、B.subtilisWD23和B.subtilisK在培养13h时菌体数量达到最大值,确定紫外诱变时菌体培养时问为13h。Chryseobacteriumsp.HL-28发酵产酶培养23h时,酶活性达到最大,B.subtilisWD23和B.subtilisK发酵产酶培养11h时,酶活性达到最大。以Chryseobacteriumsp.HL-28、B.subtilisWD23和B.subtilisK为出发菌株,紫外线诱变筛选出3个突变株：Chryseobacteriumsp.H30、B.subtilisW12和B.subtilisK116,酶活力比出发菌株分别提高了426.53%、8.72%和13.97%。以W12和K116为出发菌株,利用甲基磺酸乙酯进行化学诱变,筛选出2个突变株：B.WL-12和B.subtilisKL-116,酶活力比出发菌株分别提高了1.29%和3.97%。以B.subtilisWL-12和B.subtilisKL-116为出发菌株,经过60Co射线诱变,筛选出2个突变菌株：B.subtilisWLY-12和B.subtilisKLY-116,酶活力比出发菌株分别提高了16.89%和7.72%,酶活力分别达到4181.82U/mL和4095.48U/mL。比最原始的出发菌株B.subtilisWD23和B.subtilisK提高了28.72%和27.65%。诱变研究结果表明,物理诱变效果好于化学诱变。(3)B.subtilisWLY-12Man基因的克隆与表达根据GenBank上公布的Man基因序列,采用primerpremier5.0设计引物,梯度PCR扩增Man基因序列,经测序该基因有1089bp,该序列在GenBank注册登录号为KC979152。Man基因与表达载体pPIC9K用T4DNA连接酶连接,获得重组表达载体pPIC9K/Man。将重组表达载体电转化到酵母菌GS115中,通过直接PCR鉴定表明得到了pPIC9K/Man/GS115阳性菌株。经过甲醇诱导72h后,丙酮沉淀蛋白,经SDS-PAGE电泳检测到重组蛋白,分子量约为41kDa。用魔芋胶作底物,DNS方法测定重组β-甘露聚糖酶的活性达5156.742U/mL,比B.subtilisWLY-12的β-甘露聚糖酶活性提高了23.31%。(4)重组β-甘露聚糖酶分离纯化及其酶学特性研究发酵培养pPIC9K/Man/GS115酵母菌,上清液即为粗酶液。粗酶液经85%饱和度的硫酸铵盐析、透析脱盐、PEG20000浓缩、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析后获得纯化的重组蛋白15mL,总酶活54183.9U,总蛋白3.75mg,甘露聚糖酶比活力14449.04U/mg,收率10.51%,纯化倍数9.70,纯化效率较高。重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测到单一蛋白条带,得到电泳纯的蛋白质。飞行质谱拼接的肽段与NCBI中已经公布的甘露聚糖酶同源性高达99%,表明分离纯化步骤合理,结果可靠。研究发现重组甘露聚糖酶发挥催化作用的最适pH为6.3,最适温度是65℃。Al3+、Hg+、Fe2+和Fe3+对重组酶有强抑制作用,K+、NH4+、Li+、Zn2+和Mn2+对重组酶有轻微抑制作用,SDS和EDTA对酶有抑制作用,Mg2+和Ba2+对该酶的影响不大,Na+和Ca2+对酶有微促进作用,Co2+对该酶有促进作用。NaCl浓度在150mg/mL以下,对酶的影响表现为促进作用。
【作者】李慧玲；
【导师】赵敏；
【作者基本信息】东北林业大学，森林生物工程，2014，博士
【关键词】β-甘露聚糖酶；菌株；选育；重组；酶学特性；

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