猴头菌麦角甾醇高产菌株筛选及代谢调控的研究

【摘要】猴头菌(HericiumerinaceumPers.)又名猴头菇,在分类学上隶属菌物界隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agariomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、齿菌科(Hydnaceae),猴头菌属(Hericium)。猴头菇是珍贵的药食兼用菌,不仅营养丰富还具有巨大的药用价值。猴头菌的主要活性物质为猴头多糖,除此之外还有低聚糖、蛋白质、脂肪酸、萜类化合物、酚类化合物、吡喃酮类化合物等。近年来研究表明,甾醇类等小分子物质在降胆固醇、抗氧化、抗癌、抗炎、防治前列腺疾病等方面具有显著作用。甾醇类物质对胃黏膜有保护作用,猴头菌药物对胃炎有较好的疗效,这可能与猴头菌中的甾醇类物质有关。因此,深入开展对猴头菌次生代谢物质研究,通过人为调控,提高活性物质的含量,可以促进猴头菌在医药领域的应用。本研究以猴头菌HericiumerinaceusPers.)为试验材料,通过液体发酵培养、栽培试验对10个猴头菌株的麦角甾醇合成能力进行了比较,筛选出易于培养、甾醇产量高的猴头菌株,研究了紫外线处理、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导对于甾醇合成的影响,以及在诱导过程中相关酶的活性变化规律,采用抑制性差减杂交(SSH)作为研究手段,构建猴头菌在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导下麦角甾醇合成相关相关基因cDNA文库,从消减文库中筛选特异基因片段并进行初步的生物信息学分析,对筛选的部分基因进行RT-PCR验证。主要研究结果如下：1.猴头麦角甾醇高产菌株的筛选选用10个野生猴头菌株,通过液体培养比较不同菌株菌丝产量及麦角甾醇含量。经综合比较,5号和10号两个菌株菌丝生长能力强,麦角甾醇产量高,菌丝产量分别超出均值35.9%、45.7%,麦角甾醇产量分别超出均值30.7%、36.0%；5号和10号菌株可作为液体培养的首选菌种。栽培中,5号、10号菌株综合农艺性状较好,子实体具有较好的产量和商品性,可以作为商品栽培菌种推广；4号、6号、.9号合成甾醇能力相对较强,子实体中麦角甾醇含量相对较高,但形态稍差,可作为药用深加工栽培品种使用。在液体培养基中,糊精、麦芽糖、豆粉和酵母粉不仅可以提高菌丝的生长量,而且促进角甾醇代谢合成,提高麦角甾醇的含量。麦角甾醇的合成在子实体生长过程中呈动态变化,成熟期含量最高,达到成熟时适时采收,会保持活性成分的含量。2.猴头菌麦角甾醇代谢调控技术利用5号菌株,研究了紫外线、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理对于猴头菌生长量及甾醇代谢的影响。综合比较,SA和MeJA对于甾醇的代谢有明显的调控效果。在一定时间内茉莉酸甲酯还能提高漆酶、蛋白酶、多酚氧化酶的活性,产生防御应答。利用SA和MeJA调控甾醇代谢的方法如下：培养条件：培养基采用马铃薯(去皮)200g,麦芽糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,琼脂14g,蛋白胨1g,水1000ml,pH自然。培养基装瓶量为100m1,接种后25℃静止培养2d,25℃,150r/min,震荡培养,在培养过程中分别加入不同浓度的SA和MeJA。SA处理：在接种后的第5d向培养基中加入无菌SA,最佳添加浓度为100μmol/L,接种后第9的收获菌丝,菌丝体中麦角甾醇含量提高了42%；MeJA处理：在接种后的第8d向培养基中加入无菌MeJA,最佳添加浓度为50μmol/L,接种后第12d收获菌丝,菌丝体中麦角甾醇含量提高了25.82%。3.MeJA处理条件下猴头菌消减文库的构建成功构建了MeJA诱导下猴头菌的cDNA消减文库,检测文库具有较高的消减效率。随机挑取698个克隆进行测序,经过序列拼接和分析得到309个基因。其中在正向消减库中获得280条高质量的ESTs序列,去除冗余序列后,在MhmrA消减库中筛选到164个特异基因片段,平均长度为424bp,文库的冗余度为41.43%；在反向MhmrB消减库中获得331条高质量的ESTs序列,去除冗余序列后,在MhmrA消减库中筛选到145个特异基因片段,平均长度为292.1bp,文库的冗余度为56.19%；通过对正向文库164条EST序列进行功能注释,将获得功能注释的ESTs序列进行GO分类,归类结果表明,翻译、核糖体结构类基因所占比例最大,占21.13%；其次是翻译后修饰、蛋白转换和分子伴侣类基因,占12.68%；碳水化合物转运与代谢和能量产生于转换类基因各占11.27%；氨基酸转运与代谢和无机离子转运与代谢个占7.04%；细胞骨架占5.63%,细胞骨架类基因占4.23%,其它如染色体结构、脂质转运与代谢、防御代谢、胞内传输、辅酶转运与代谢等基因所占比例较小,各占1.41%。由此可见茉莉酸甲酯对猴头菌的影响是一个复杂的、涉及到众多基因的激活和蛋白代谢的过程。而反向文库中获得功能注释并GO分类序列非常少,仅有6条序列,说明大部分大量表达的基因被抑制,而只有与MeJA相关的基因得到表达
【作者】戴肖东；
【导师】詹亚光；
【作者基本信息】东北林业大学，森林生物工程，2014，博士
【关键词】猴头菌；麦角甾醇；菌株筛选；代谢调控；消减文库；

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