原油降解真菌分离和降解及芳香烃降解基因的转录谱分析

【摘要】石油作为能源被广泛利用,但在石油开采、运输及生产过程中对土壤环境产生的污染也是严重困扰人类的问题。污油的处理方法很多,包括物理、化学和生物等修复方法,其中生物修复以安全、经济,无二次污染等优点备受关注。但原油中组分复杂,污染土壤的生物修复难度也很大,尤其是石油中的芳香烃类成分更难被微生物所利用,因此,分离筛选原油降解微生物,研究其对原油组分的代谢特点,并采用转录组测序技术探讨原油降解真菌的芳香烃降解相关基因表达,为今后芳香烃高效降解菌的筛选和开发提供技术支持,从而进一步提高原油污染的生物修复效率。本研究从大庆油田地区长期油污土壤中分离得到了12株高效的原油降解真菌,通过菌落形态、菌丝形态、生理生化实验及ITS序列对已分离真菌进行了鉴定,确定其近缘种属：H1、H3、H9、X9与X12属于镰刀菌属(Fusariumsp.);H2属于土曲霉(Aspergillusterreus),H4属于雅致放射毛霉(Actinomucorelegans),X1属于植物内生菌(Fungalendophyte),X3属于真菌菌株(Fungalsp.),X7属于黄白生丛赤壳菌(Bionectriaochroleuca),X11属于葡萄穗酶菌(Stachybotryssp.),D4属于木霉菌(Trichodermaatroviride)。在液体培养条件下研究了pH、氮源和磷源对12种真菌菌丝干重的影响,结果发现12种原油降解真菌均在pH7.0时生长旺盛,获得较高的菌丝干重,H9和X12真菌在以NH4NO3为氮源时生物量最高,H4真菌的最适氮源为NaNO3,其余9种原油降解真菌均以KNO3为氮源时达到最大平均菌丝干重。KH2PO4和K2HPO4/KH2PO4(1:2)双磷源都能使12种真菌具有较高的生物量,且两种磷源对菌丝生长影响不显著。影响真菌原油降解率的因素有很多,本文主要探讨了培养条件、pH、N/P比值、NaCl浓度和原油浓度对12种原油降解真菌原油降解率的影响。总体来说,当pH、N/P比值、NaCl浓度确定时,真菌在液体培养条件下的原油降解率普遍高于土壤中的原油降解率。在pH7.0时多数真菌表现为最高降解率,在pH8.0～9.0时真菌也能维持较高的降解率。同时12种真菌的原油降解率随NaCl浓度的升高而降低,但NaCl浓度为10%时X9和D4菌株还有20%以上的原油降解率,可以看出从大庆油污土壤中分离的原油降解真菌具有一定的耐盐碱性,这与菌种对大庆地区的盐碱土壤特质的适应性是相符的。12种真菌菌株中X1菌株在液体培养和土壤培养中都显示出了最高的原油降解率。真菌对石油烃类物质的降解代谢多数是从单加氧开始的,但在代谢过程中不同的菌种有多种复杂的酶系参与,本文对12种原油降解真菌在1%原油浓度下几种主要降解相关氧化还原酶活性进行研究,探讨真菌在原油降解过程中木质素过氧化物酶(LiginPeroxidase,LiP)、锰过氧化物酶(ManganesePeroxidase,MnP)和漆酶(Laccases,Lac)活力与原油降解率之间的关系。结果发现,各菌株产酶种类和活力各不相同,除X12的LiP和H4的Lac的活性受原油的抑制外其余菌株的酶活性都能够在原油的诱导下显著升高。Lac的活性与真菌土壤条件原油降解率呈现极显著正相关性；LiP活性与液体和土壤培养条件下原油降解率之间的相关系数均小于0.3；而MnP活性与原油降解率之间呈现负相关。通过对能够降解芳香烃的X1菌株的转录组测序、过滤和拼接后得到了34003个转录本,即Unigene,并在Nt、Nr、GO等7个数据库中成功注释了28660个基因片段。GO分类显示与烷烃代谢相关的酶基因共16376个,其中在GO功能注释中功能为氧化还原酶作用于CH-CH、氧化还原酶作用于双酚及相关物质、氧化还原酶作用于CH-OH、转移酶作用于酰基、转移酶作用于烷基或芳基、碳-碳裂解的酶基因数量都相对较多。KEGGPathway富集结果显示X1菌株的基因集中在碳水化合物代谢途径中的最多,有527个,占被注释的基因总数的12.3%,并且其中细胞芳香化合物代谢和杂环代谢途径中的基因数量显著高于其他代谢途径中的基因数量。比较X1菌株在含茚的无机盐培养基处理和PDA培养基非处理对照的基因表达水平,发现1216个上调基因中,在萘降解通路和氧化磷酸化通路中上调基因的比例最高,结合GO分类中比例较高的酶基因,预测茚的代谢可能与萘的代谢有极相似的过程。
【作者】曲丽娜；
【导师】王秋玉；
【作者基本信息】东北林业大学，遗传学，2014，博士
【关键词】油污土壤；原油降解真菌；转录组测序；基因差异表达；

【参考文献】
[1]程俊儒.中国石油广东成品油二次物流配送优化研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[2]沈明.面向跨国企业的供应链管理[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[3]刘丽.聚类算法研究与应用[D].江南大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[4]魏娟娟.磁性金属铁、镍纳米粒子及其复合结构的合成与研究[D].西北师范大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[5]鲁欢.功能对等理论指导下《塞班瑟夫赖德有限责任公司私募备忘录》的翻译[D].烟台大学,英语笔译,2014,硕士.
[6]李小龙.带设备层的大底盘多塔楼结构抗震性能研究[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[7]陈辉,张家树,张超.实数编码混沌量子遗传算法[J].控制与决策,2005,11:102-105.
[8]郑龙珍,韩奎,熊乐艳,陶堃,叶丹,邹志君.石墨烯负载型铂基金属间化合物的制备及其在燃料电池中的应用[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第10分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[9]郭欣欣.江汉平原浅层含水层系统中砷释放与迁移过程研究[D].中国地质大学,地下水科学与工程,2014,博士.
[10]曾开来.无线数字资讯传播系统[D].武汉理工大学,2003.
[11]李三祥.经尿道前列腺等离子电切术联合剜除术治疗前列腺增生症临床研究[D].南方医科大学,泌尿外科（专业学位）,2014,博士.
[12]刘池.《红楼梦》双关研究[D].扬州大学,汉语言文字学,2011,硕士.
[13]甘健民,薛敬意,谢寿昌.云南中山湿性常绿阔叶林中降雨对养分淋溶的影响[J].植物生态学报,1996,03:279-284.
[14]赵文杰.基于三维电视深度图提取算法的研究[D].山东大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[15]陈小清.基于激光反馈自混合干涉的超声数控机床刀具振动测量初步研究[D].国防科学技术大学,光学工程,2012,硕士.
[16]瞿少魁.NX CAM/VERICUT双环境下面向螺旋曲面产品制造的仿真系统研究[D].华侨大学,机械工程（专业学位）,2014,硕士.
[17]郭燚.唐钢动力厂精细化管理研究[D].燕山大学,工商管理,2012,硕士.
[18]沈元军.马克思技术思想的风险意蕴研究[D].辽宁工业大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[19]谭玲玲.滇西地区翼状胬肉分布特点及证型/年龄/性别相关性和复发性研究[D].成都中医药大学,中西医结合基础,2012,硕士.
[20]李英毅.ZH公司CRM系统构建研究[D].电子科技大学,2005.
[21]李燕.新斯的明对经银环蛇毒素处理后的离体大鼠膈肌肌条张力的影响[D].广州医科大学,急诊医学,2013,硕士.
[22]张光帅.新媒体艺术与传统绘画[D].山东师范大学,艺术（专业学位）,2013,硕士.
[23]邱伟伟.基于网络编码的Ad hoc网络多径路由技术研究[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[24]胡曼.从“迦陵频伽”图像的象征意义看唐代佛教音乐美学思想[D].西安音乐学院,音乐学,2014,硕士.
[25]朱刚,马良.多目标函数优化的元胞蚂蚁算法[J].控制与决策,2007,11:1317-1320.
[26]陈昌军.低幅度同层油藏再认识研究[D].东北石油大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]雷学成.江苏省北部地区土壤系统分类基层分类单元划分研究[D].南京农业大学,土壤学,2012,硕士.
[28]葛郁.成大方圆连锁药店顾客满意度研究[D].大连理工大学,企业管理,2003,硕士.
[29]赵鹏鹏.情绪启动下注意范围对变化盲视的影响[D].郑州大学,基础心理学,2013,硕士.
[30]施蕊明.梁柱托换节点小剪跨比托换梁受力性能的试验研究[D].山东建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[31]代晓微.后腹腔镜下肾输尿管全长切除加经尿道膀胱袖状切除治疗肾结核的疗效分析[D].吉林大学,临床医学（专业学位）,2014,硕士.
[32]瞿海妮,许维胜,DREYFUSGerard.基于递归最小二乘支持向量机的动态系统建模研究[J].控制与决策,2009,11:1663-1667+1672.
[33]李凡长.基于DFL的多Agent协调工作机制研究[J].自动化学报,2003,06:1002-1007.
[34]阿麦特.土耳其—中国贸易特征及其发展趋势[D].宁夏大学,政治经济学,2014,硕士.
[35]石贸然.A银行客户关系管理系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[36]刘显艳.语言培训机构雅思/托福留学备考课程设计探究[D].华中师范大学,教育学,2013,硕士.
[37]石金龙.基于CCD的纳米金标试纸检测系统研制[D].哈尔滨理工大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[38]贾影.碱性液腐蚀冶金多晶硅太阳电池表面织构的研究[D].内蒙古大学,物理电子学,2014,硕士.
[39]王振彦.氨甲环酸干预股骨转子间骨折术后隐性失血的临床对照研究[D].青岛大学,骨外科,2013,硕士.
[40]梁松岳.脑瘤方加放疗治疗恶性脑胶质瘤的临床疗效观察[D].湖南中医药大学,中西结合（专业学位）,2013,硕士.
[41]李涛.顾客信任对淘宝商家营销策略的影响研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]于澄洁.首届全国高校图书馆服务创新案例大赛暨研讨会综述[J].科技文献信息管理,2014,03:42-46.
[43]陈光.转型时期我国民办高校治理模式研究[D].南京师范大学,教育经济与管理,2012,硕士.
[44]蒋佳兴.高中信息技术形成性测评支持系统研究[D].山西师范大学,现代教育技术（专业学位）,2013,硕士.
[45]夏忠锋.低碳镁碳材料基质组成的优化研究[D].武汉科技大学,2012.
[46]盛春.三疣梭子蟹光感受器在不同光适应条件下超微结构变化的研究[D].上海师范大学,动物学,2004,硕士.
[47]刘盼.我国关于股东优先购买权性质与效力的理论与实践[D].中国政法大学,比较法学,2013,硕士.
[48]侯亚敏.几类带有不同干扰因素的捕食系统的研究[D].山西师范大学,应用数学,2014,硕士.
[49]张馨方.洱海流域土地利用与生态系统服务价值变化研究[D].云南财经大学,土地资源管理,2014,硕士.
[50]王宁.论增设虐待儿童罪[D].广东财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.