Treg细胞和Foxp3、TGF-β1基因多态性在子痫前期发生中的作用

【摘要】子痫前期是妊娠的特有疾病，是孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一。子痫前期的发病机制尚不十分清楚，目前认为其发病机制主要包括遗传缺陷、胎盘微环境的损伤及免疫异常等。三种机制在不同患者中单独或联合作用，导致胎盘功能异常。其中，免疫和遗传学因素越来越引起人们的重视。免疫学机制认为妊娠成功取决于母胎间免疫微环境平衡和免疫耐受的维持，一旦平衡失调，将打破免疫耐受，使免疫排斥反应增强，可能导致子痫前期的发生。T细胞是免疫系统中主要效应细胞，在机体免疫应答中发挥重要作用。近年来研究发现，CD4+CD25+Foxp3+T细胞（regulatoryTcell，Tregcell）是一类具有特定表型和重要功能的调节性T细胞亚群，具有免疫调节和免疫抑制作用，能够识别自身抗原并抑制自身反应性T细胞的免疫反应，是自身免疫耐受不可缺失的一环，在维持自身免疫稳定方面起重要作用。叉头状螺旋转录因子3(forkheadboxprotein3,Foxp3)可特异表达于胸腺和外周淋巴组织中天然CD4+CD25+Treg细胞亚群上，是CD4+CD25+Treg细胞发育调控机制中的重要开关。CD4+CD25+Treg细胞与效应性T细胞的免疫失衡，可导致自身反应性T细胞的活化，是自身免疫性疾病发病机制的中心环节。目前已证实Foxp3基因多态性可导致CD4+CD25+Treg功能改变，并与多种自身免疫性疾病、炎症及肿瘤的发生发展相关，而在子痫前期的发生中，Foxp3基因多态性是否能影响母胎免疫功能及母体胎盘免疫微环境，尚不清楚，未见相关报道。我们假设Foxp3遗传异质性决定了子痫前期个体发病时间和(或)病情的差异，那么意味着Foxp3基因多态性可能决定着子痫前期的易感性，这些研究有利于我们探索人Foxp3基因多态性在子痫前期发生中的作用，为子痫前期发病机制的研究提供新思路。转化生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）是调节细胞生长和分化的细胞因子，在维持自身免疫耐受和T细胞稳态方面发挥着重要作用。研究表明，适量的TGF-β1对胎儿生长发育是必需的，蜕膜和滋养细胞中TGF-β1的合成、分泌对胎盘和胚胎的生长发育起着重要作用。而TGF-β1表达异常可以使滋养细胞向子宫内层浸润受限，子宫胎盘血流减少，致使滋养细胞浅植入和子宫胎盘血管的异常高阻抗，形成子痫前期的病理生理改变，导致子痫前期的发生。TGF-β1表达异常与子痫前期发生可能涉及了十分复杂的分子调控机制。TGF-β1存在基因多态性，其基因多态性可能影响血清中TGF-β1表达水平，最新的研究显示荷兰人和韩国人TGF-β1特定基因型是子痫前期的危险因素，TGF-β1基因多态性是通过何种机制导致子痫前期的发生，目前仍不清楚。由于该基因在不同地域和种族之间存在较大基因多态及基因型差异。对其基因多态性和不同基因型与子痫前期易感性的研究，有利于寻找子痫前期的易感基因。白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是Th17细胞（Thelpcell17，Th17）分泌的促炎因子，可以诱导白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF-α)等多种细胞因子的表达，并协同白介素-1（Interleukin-1，IL-1）和TNF-α激活急性期蛋白、诱导基质金属蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)的合成，参与多种自身免疫性疾病的发生和发展，有学者认为IL-17可能参与了胚胎着床及滋养细胞浸润过程，推测Th17细胞在妊娠过程中可能发挥着一定作用。研究表明动脉粥样硬化、心绞痛和心肌梗死等心血管疾病患者血清中IL-17浓度明显升高，IL-17与早产、胎膜早破、宫内感染的发生密切相关。IL-17是否与子痫前期的发生相关，目前尚不十分清楚。Treg细胞及Foxp3、TGF-β1、IL-17等分子在子痫前期发病机制中的作用如何，Foxp3和TGF-β1基因多态性是否是子痫前期发生的危险因素，Foxp3和TGF-β1基因是否是子痫前期发生的易感基因，这些都值得深入研究与探讨，以便为子痫前期的预测和预防提供理论依据和实验基础。第一部分Treg细胞和TGF-β1在子痫前期患者体内水平研究目的探讨CD4+CD25+Treg细胞及TGF-β1水平在子痫前期发病过程中的作用，为研究子痫前期免疫发病机制提供实验基础。方法研究对象来源于广州市重症孕产妇救治中心和广州医科大学附属第三医院产科住院孕产妇，入选时间为2011年10月~2012年12月，子痫前期患者入选数量为68例，其中轻度子痫前期患者33例，重度子痫前期患者35例，子痫前期诊断标准依照全国统编教材《妇产科学》第7版。正常妊娠组：随机选择同期住院的正常妊娠妇女30例。两组研究对象均排除内科合并症及妊娠期糖尿病，其年龄、产次及孕前体重指数均无统计学差异。子痫前期患者均为初治，既往均未输血及接受免疫抑制剂治疗。采用流式细胞术(flowcytometry，FCM)和ELISA法检测入选研究对象外周血Treg细胞和TGF-β1水平。实验数据以均数±标准差（X±s）表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，以单因素方差分析进行多组间比较，组间比较采用LSD法，相关分析用spearson线性相关分析方法，以a=0.05为检验水准。结果轻度子痫前期和重度子痫前期患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞比例分别为6.34%±0.978%和4.31%±0.85%，显著性低于正常妊娠妇女（12.38%±2.63%），P＜0.05；轻度子痫前期和重度子痫前期患者组TGF-β1水平分别为112.63±24.43ng/mL和134.72±34.86ng/mL，显著性高于正常妊娠组（87.67±21.24ng/mL），P<0.05，其水平随病情严重程度的增加而升高。结论子痫前期患者外周血Treg细胞水平显著性下降，TGF-β1表达水平显著性升高，Treg细胞和TGF-β1可能在子痫前期发病过程中发挥重要的作用。第二部分TGF-β1、Foxp3及IL-17表达水平在子痫前期发生中的作用目的通过研究子痫前期患者胎盘组织中TGF-β1、Foxp3和IL-17的表达水平变化，探讨三者在子痫前期发病过程中的作用，为研究子痫前期免疫发病机制和寻找新的免疫调控治疗策略提供实验依据。方法研究对象和数量、入选标准、排除标准与第一部分相同。轻度子痫前期组、重度子痫前期组及正常妊娠组均为第一胎及剖宫产手术结束分娩，摘取胎盘组织，采用免疫组化法检测TGF-β1、Foxp3和IL-17的表达情况。阳性细胞必须符合下列要求：镜下组织细胞结构清晰，阳性颗粒定位好，染色明显高于背景。阳性结果判断标准：标本组织、细胞或基质着棕黄色，结果判定采用半定量积分法，根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅记分。使用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，临床资料为计量资料采用秩和检验，实验数据运用spearman等级直线相关回归法进行相关性分析，以a=0.05作为检验水准。结果轻度子痫前期和重度子痫前期组胎盘TGF-β1的阳性表达率分别为75.76%和85.71%，显著性高于正常妊娠组（36.67%），P<0.05；Foxp3在轻度子痫前期和重度子痫前期组的表达阳性率分别为51.52%和28.57%，显著低于正常妊娠组(86.67%)，P＜0.05。IL-17在轻度子痫前期和重度子痫前期组胎盘的表达阳性率分别为81.82%和91.42%，显著性高于正常妊娠组（40%），P<0.05。胎盘组织中IL-17和TGF-β1水平的升高与胎盘及胎儿重量减少呈显著负相关；Foxp3水平的降低与胎盘及胎儿重量减少呈显著正相关。结论1.子痫前期患者胎盘组织中的Foxp3表达水平显著下降及IL-17表达水平显著升高，提示Th17/Treg细胞比值失衡可能在子痫前期致病中发挥作用，可导致免疫抑制功能减弱，炎症反应增强，引发母胎免疫耐受失衡，并影响胎盘及胎儿的发育。2．TGF-β1水平在子痫患者体内显著升高，并与病情程度呈显著正相关，TGF-β1主要由胎盘滋养细胞产生，异常高表达的TGF-β1可能主要发挥促炎作用，增强炎症反应，并通过对血管内皮细胞的作用，促进血压升高，参与子痫前期的病理过程。第三部分TGF-β1基因多态性对子痫前期发生的易感性研究目的通过TGF-β1多态性基因位点的序列分析，探讨TGF-β1基因多态性分布及基因型变异对子痫前期发生的易感性，阐明其在子痫前期发生中的分子机制。方法选择2011年10月~2012年12月在广州市重症孕产妇救治中心和广州医科大学附属第三医院产科住院的子痫前期患者156例，子痫前期诊断标准依照全国统编教材《妇产科学》第7版。正常妊娠组：随机选择同期住院的正常妊娠妇女252例。两组研究对象均排除内科合并症及妊娠期糖尿病，其年龄、产次及孕前体重指数均无统计学差异。采集与分离外周血白细胞，运用酚-氯仿法提取基因组DNA，设计特异性引物，采用PCR-RFLP和序列分析方法，测定TGF-β1-509C/T和+869T/C等位基因及基因型频率的分布，用ELISA法检测子痫前期组和正常妊娠组血清中TGF-β1的水平，用SPSS13.0进行统计学处理。结果TGF-β1+869T/C位点基因型分别为CC、CT及TT，其基因型频率在子痫前期组分别为33.33％、62.18%及4.49％，正常对照组基因型频率分别为13.09％、48.41％及38.49％，子痫前期组TGF-β1+869T/C位点的CC、CT基因型频率显著高于正常妊娠对照组（P＜0.01）；而TT基因型频率显著低于正常妊娠对照组，P＜0.01；子痫前期组+869T/C位点的C等位基因频率（64.42％）显著高于正常妊娠组（37.30％），P＜0.01，T等位基因频率显著低于正常妊娠组，P＜0.01；TGF-β1+869T/C位点的不同基因型能显著影响其血清中TGF-β1表达水平，TGF-β1+869位点CC基因型个体TGF-β1表达水平最高，CT基因型个体次之，TT基因型个体最低，三者之间TGF-β1水平存在显著差异，F值为2.98，P＜0.05。TGF-β1-509C/T位点的基因型为CC、CT及TT，其基因型频率在子痫前期组分别为11.54％、52.57%及35.89％，正常妊娠组基因型频率分别为13.89％、46.82％及39.29％，两组间基因型频率无统计学差异，P＞0.05。TGF-β1-509C/T位点的基因型与TGF-β1水平无显著相关。TGF-β1+869CT/-509CT、TGF-β1+869CC/-509CT及TGF-β1+869CC/-509TT联合基因型频率在子痫前期组均显著高于正常妊娠组，P＜0.05。而TGF-β1+869T/509CC、TGF-β1+869TT/-509CT及TGF-β1+869TT/-509TT联合基因型频率在子痫前期组均显著低于正常妊娠组，P＜0.01。结论1.子痫前期患者TGF-β1+869T/C位点基因型CC和CT频率显著增高、TT频率显著下降、C等位基因显著增加及T等位基因显著下降，提示TGF-β1+869T/C位点可能是中国广东地区汉族人群子痫前期发生的危险因子。2.TGF-β1-509C/T位点可能不是子痫前期发病的独立危险因素。该位点与TGF-β1+869T/C位点联合作用能显著增加罹患子痫前期的风险，两位点共同作用可能易形成高危的基因型诱导子痫前期的发生。第四部分Foxp3基因多态性对子痫前期发生的易感性研究目的通过Foxp3多态性基因位点的序列分析，探讨Foxp3基因多态性分布及基因型变异对子痫前期发生的易感性，阐明其在子痫前期发生中的分子机制。方法研究对象、入选标准及排除标准与第三部分相同。采集和分离外周血白细胞，运用酚-氯仿法提取基因组DNA，设计特异性引物，采用扩增阻碍突变系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）方法检测Foxp3-6054（deletion/ATT，rs5902434）位点、-3279（A/C，rs376158）位点及-924（A/G，rs2232365）位点，对基因位点进行序列测定，确定多态性位点的基因型。分别对Foxp3-6054、-3279及-924等三个位点的基因型及等位基因型频率进行统计学分析。结果Foxp3-6054位点的基因型分别为TT、TA、AA，其基因型存在多态性，在子痫前期患者中基因型TT频率显著性低于正常妊娠组，对基因型进行单独和联合Logistic回归分析，结果显示，在Foxp3-6054T/A位点多态性中，TT基因型可减少罹患子痫前期的风险，相对危险系数RR=0.734，95%可信区间（95%CI）为0.562-0.960，χ2=5.439，P＜0.01；联合基因型AT+AA显著增加罹患子痫前期的风险，相对危险系数RR=1.206，95%CI为1.035-1.405，χ2=5.439，P＜0.01。Foxp-3279位点AA、CA、CC基因型在子痫前期组分别为0.0128、0.2564和0.7308，C、A基因频率分别为0.8589和0.1411，其基因型频率和A、C基因频率与正常妊娠组相比，均无显著性差异，P＞0.05。但Foxp3-6054AA/-3279CC联合基因型频率，子痫前期组显著性高于正常妊娠对照组，P＜0.01；Foxp3-6054TT/-3279CC联合基因型频率，子痫前期组显著性低于正常妊娠组，P＜0.01。Foxp3-924位点各基因型和基因频率及其Foxp3-6054/-924联合基因位点在子痫前期组与正常妊娠组之间无显著性差异，P＞0.05。将TGF-β1与Foxp3多态位点不同组合后综合分析，结果显示：Foxp3-6054AA/TGF-β1+869CC、Foxp3-6054AT/TGF-β1+869CC、Foxp3-6054AT/TGF-β1+869CT和Foxp3-6054TT/TGF-β1+869CC等联合基因型频率在子痫前期组显著高于正常妊娠组，P<0.05。结论1.Foxp3-6054位点TT基因型频率在子痫前期患者中显著下降，提示TT频率的下降可能具有罹患子痫前期的危险性，Foxp3-6054位点可能参与了子痫前期的发生。2.Foxp3-924和Foxp3-3279位点基因多态性在子痫前期患者中无显著性差异，提示这两个位点可能不是子痫前期发病的独立危险因素。3.Foxp3-6054AA/-3279CC和Foxp3-6054TT/-3279CC联合位点基因型在子痫前期组与正常妊娠组之间存在显著性差异，两个位点的联合基因型可能为子痫前期的易感基因型。4.TGF-β1和Foxp3两基因相关位点联合作用罹患子痫前期的风险性显著高于单一基因位点作用，提示子痫前期可能是多基因共同作用引起的疾病，TGF-β1和Foxp3不同位点可能相互作用形成高危险基因型参与子痫前期的发生。
【作者】陈晞明；
【导师】肖建华；
【作者基本信息】南华大学，免疫学，2013，博士
【关键词】子痫前期；Treg细胞；Foxp3；TGF-β1；IL-17；基因多态性；

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