ATD致粒细胞缺乏骨髓象及相关miRNA的初步研究

【摘要】第一部分ATD导致粒细胞缺乏患者骨髓特点分析目的：分析抗甲状腺药物（Antithyroiddrug,ATD）治疗导致粒细胞缺乏症患者骨髓象特点及相关临床资料，探索骨髓象特点与粒细胞恢复情况及临床预后的关系。方法：检索2008年1月～2011年12月南华大学附属第一医院、南华大学附属郴州医院、南华大学附属第二医院血液科及内分泌科收治的有完整诊疗过程记录及骨髓检查结果的住院病历,骨髓涂片提示取材不理想的病例予以剔除。确定33例为本研究的对象。总结分析其骨髓象特点、粒细胞恢复时间、热程长短等指标。结果：ATD导致粒细胞缺乏患者骨髓特点可以分为粒系成熟障碍型及粒系再生障碍型两类。33例粒缺患者中骨髓象为成熟障碍型13例(39.4%)、再生障碍型20例(60.6%)，再生障碍型组骨髓增生活跃15例，增生减低5例。成熟障碍型组骨髓增生明显活跃3例，增生活跃10例。成熟障碍型患者粒细胞上升至正常平均（4.7±1.0）天，而再生障碍型为（8.0±2.8）天,两组比较差异有显著性（P＜0.01），发热天数在成熟障碍型组为（3.6±2.5）天，再生障碍型组为（8.6±3.1）天，成熟障碍型组热程明显短于再生障碍型组（P＜0.01），2例死亡患者骨髓检查为再生障碍型。结论：1、ATD导致粒细胞缺乏患者骨髓象可以分为粒系再生障碍型和成熟障碍型两类，以粒系再生障碍型为主。2、骨髓象为成熟障碍型患者较再生障碍型患者粒细胞恢复快，发热时间短，预后好。第二部分ATD导致粒细胞缺乏患者血浆差异表达miRNA的筛选及鉴定目的：研究ATD导致粒细胞缺乏患者粒细胞缺乏时及粒细胞恢复正常后血浆miRNA表达谱的变化。方法：选取年龄、性别、服用ATD类别及疗程基本匹配的5名ATD导致粒细胞缺乏患者，抽取粒细胞缺乏时及粒细胞恢复正常1周后的外周静脉血各2ml，分离血浆提取总RNA，应用AgilenthumanmiRNA(8*60K)V16.0芯片分析粒细胞缺乏时及粒细胞恢复正常后miRNA表达谱的差异。生物信息学分析表达差异明显的miRNA的靶基因及功能。qRT-PCR验证低表达hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b在ATD导致粒细胞缺乏时及粒细胞恢复正常后及服用ATD3月以上未出现粒细胞减少患者血浆中的表达情况。结合患者临床资料，分析hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b表达变化与患者服用ATD类别及骨髓特点分类的关系。结果：通过对芯片进行图像扫描和数据分析，筛选获得32个ATD导致粒细胞缺乏相关miRNA，其中9个表达上调(Foldchange,FC≥2)，23个表达下调（FC≤0.5）；显著上调的有hsa-miR-200、hsa-miR-756、hsa-miR-320a、hsa-miR-21、hsa-miR-30a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320e(FC≥5)，显著下调的有hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b、hsa-miR-1234、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-15a、hsa-miR-197、hsa-miR-144（FC≤0.2）。生物信息学分析提示低表达的miRNA与细胞凋亡及细胞周期调控密切相关，高表达miRNA多参与基因转录调控、细胞增殖、炎症反应等过程。进一步对低表达hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b的qRT-PCR验证，证实了芯片结果可靠。qRT-PCR验证的4个miRNA表达变化在服用MMI和PTU两组患者间无明显差异（p＞0.05）。且4个低表达miRNA在骨髓分类为粒系再生障碍型和粒系成熟障碍型两组患者间差异不明显（p＞0.05）。结论：1、通过miRNA芯片筛选及qRT-PCR检测，成功获得ATD导致粒细胞缺乏发生相关的血浆miRNA谱。2、ATD致粒细胞缺乏的miRNA表达变化与服用ATD类别及骨髓特点分类无明显相关。3、粒细胞缺乏时差异低表达的hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b等均与细胞凋亡相关，提示粒细胞凋亡增加可能是ATD致粒细胞缺乏发生的原因。第三部分Hsa-miR-20a对HL-60、U-937细胞生物学性状的影响目的：选取miRNA芯片筛选获得的显著低表达的hsa-miR-20a作为研究对象，观察hsa-miR-20a表达变化对HL-60、U-937细胞生物学性状的影响。方法：构建hsa-miR-20a低表达及高表达慢病毒载体，感染293T细胞，采用荧光检测法测定病毒的滴度。复苏培养HL-60、U-937细胞，实验分为三组：hsa-miR-20a高表达组（hsa-miR-20aup）、hsa-miR-20a低表达组（hsa-miR-20adown）、空载体对照转染组（control）。取对数生长期细胞根据病毒滴度及MOI值加入慢病毒感染，分别于感染后48h、72h镜下观察细胞形态改变，MTT及FCM检测各组细胞增殖及凋亡的情况。qRT-PCR检测各组细胞hsa-miR-20a表达变化情况。结果：成功构建低表达及高表达hsa-miR-20a的慢病毒载体，hsa-miR-20aup慢病毒滴度为4×108TU/ml,hsa-miR-20adown慢病毒滴度为8×108TU/ml。两组病毒成功感染HL-60、U-937细胞，qRT-PCR证实了感染后各组细胞hsa-miR-20a表达水平的变化，低表达hsa-miR-20a可以抑制HL-60、U-937细胞生长，促进其凋亡。而且，hsa-miR-20a低表达对HL-60细胞生长抑制及凋亡促进作用较U-937细胞更加明显（p＜0.05）。高表达hsa-miR-20a对两组细胞生长增殖及凋亡的影响与对照组无明显差异（p＞0.05）。结论：Hsa-miR-20a低表达及高表达慢病毒载体可以在HL-60、U-937细胞中实现hsa-miR-20a的低表达及高表达变化。Hsa-miR-20a低表达可抑制HL-60、U-937细胞生长，促进其凋亡。其对HL-60细胞生长抑制及凋亡促进作用较U-937细胞更加明显。第四部分Hsa-miR-20a调控粒细胞凋亡的机制研究目的：探索hsa-miR-20a调控HL-60细胞凋亡的靶向基因及其作用机制。方法：生物信息学软件在线分析hsa-miR-20a的种子序列，与细胞凋亡相关的靶向基因及其3’UTR作用位点，位点结合自由能等生物信息。选取可能的靶向作用位点构建双荧光素酶报告基因载体，检测软件预测位点的有效性。RT-PCR及Western-blot检测hsa-miR-20a表达变化对靶向基因mRNA及蛋白表达的影响。并采用Western-blot检测靶向蛋白的下游调控蛋白表达水平变化情况。免疫组化检测ATD导致粒细胞缺乏患者骨髓粒细胞中相应靶向蛋白的表达情况。结果：多生物信息学软件预测均发现hsa-miR-20a与PTEN3’UTR有很好的作用位点及结合自由能。双荧光素酶报告基因检测发现转染hsa-miR-20a高表达能使psiCHECK-2-PTEN-WT3’UTR质粒的表达水平显著下降，而对psiCHECK-2-PTEN-Mut3’UTR质粒的表达无影响。RT-PCR检测PTENmRNA水平变化发现与对照组比较，hsa-miR-20aup能显著下调PTENmRNA水平。Western-blot检测结果显示随着hsa-miR-20a表达的下降，HL-60细胞中PTEN蛋白的表达量较对照组显著上调，而PTEN下游调控蛋白p-Akt、Bcl-2表达水平下降，Bax表达升高。免疫组化检测发现粒系成熟障碍型患者骨髓粒细胞PTEN蛋白表达量较正常骨髓象有增加。结论：PTEN是hsa-miR-20a调控粒细胞凋亡的靶向基因，PTEN通过影响线粒体凋亡信号p-Akt/Bcl-2/Bax通路在ATD导致粒细胞缺乏的发生过程中起作用。
【作者】杨靖；
【导师】文格波；
【作者基本信息】南华大学，病理与病理生理学，2014，博士
【关键词】抗甲状腺药物；粒细胞缺乏症；骨髓象；粒细胞缺乏；miRNA芯片；Hsa-miR-20a；慢病毒载体；凋亡；生物信息学；hsa-miR-20a；PTEN；线粒体凋亡信号通路；

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