miR-7-5p靶向REGγ抑制人乳腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡研究

【摘要】第一章REGγ在人乳腺癌细胞株和组织中的表达目的：探讨蛋白酶体激活因子3（Proteasomeactivatorsubunit3，REGγ/PSME3/PA28γ/Ki抗原）在人乳腺癌细胞系和人乳腺癌组织中的表达情况。方法：采用半定量RT-PCR和immunoblot检测REGγ在人乳腺癌细胞系中表达情况；采用immunoblot检测REGγ在人乳腺癌组织和相应癌旁组织中的表达情况；采用Oncomine微阵列芯片在线数据库（https://www.oncomine.org/）分析REGγ在人乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达水平结果：RT-PCR结果显示REGγ在人乳腺癌细胞系中广泛表达，非成瘤细胞株（HBL100和MCF10A）表达相对较低，immunoblot结果显示REGγ蛋白水平在MDA-MB-231相对最高；4对人乳腺癌组织/癌旁组织中，癌组织中REGγ的蛋白水平均显著高于癌旁组织；Oncomine数据库的结果显示，相对于正常乳腺组织，REGγ的表达在乳腺导管内癌和浸润性导管癌中均呈不同程度的上升。结论：REGγ的mRNA和蛋白水平在人乳腺癌细胞系和组织中均呈不同程度上升，可能在乳腺癌的进程中扮演重要的作用。第二章miR-7-5p靶向调节REGγ的表达目的：验证miR-7-5p可特异结合REGγ的3端UTR(untranslatedregions),且miR-7-5p可靶向调节抑制REGγ的蛋白表达。方法：通过real-timePCR检测miR-7-5p在人乳腺癌细胞株中的表达；双荧光素酶报告基因验证miR-7-5p特异结合REGγ3′UTR的可能性；real-timePCR和immunoblot验证miR-7-5p对REGγmRNA和蛋白水平的调节作用；使用real-timePCR检测miR-7-5p和REGγ在人乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达，分析两者表达的相关性。结果：miR-7-5p在MDA-MB-231细胞中的表达最低；过表达miR-7-5p可显著抑制荧光素酶活性；miR-7-5p能促进REGγmRNA降解和抑制REGγ蛋白翻译；相对于癌旁组织，miR-7-5p在人乳腺癌组织中表达显著下调，而REGγ的表达显著上升，两者在乳腺癌组织中的表达具有负相关性。结论：miR-7-5p可通过特异结合REGγ的3`UTR促进REGγmRNA的降解以及抑制REGγmRNA蛋白翻译，在人乳腺癌组织中，两者表达的负相关性提示miR-7-5p负向调控REGγ。第三章miR-7-5p在人乳腺癌细胞中的功能机制目的：通过过表达miR-7-5p,探讨miR-7-5p在人乳腺癌细胞中扮演的角色。方法：以miR-7-5p表达较低的MDA-MB-231，MCF7细胞为研究对象，瞬时转染miR-7-5p模拟物上调miR-7-5p在MDA-MB-231和MCF7细胞中的表达，检测miR-7-5p对MDA-MB-231和MCF7细胞增殖的调节作用，并进一步在MDA-MB-231细胞中验证miR-7-5p对细胞周期，细胞凋亡，克隆形成能力的调节作用。细胞周期和细胞凋亡通过流式细胞术进行检测。结果：Real-timePCR结果显示MDA-MB-231和MCF7细胞过表达miR-7-5p成功；CCK-8结果显示miR-7-5p可显著抑制MDA-MB-231和MCF7细胞的增殖；EdU染色显示miR-7-5p可显著降低MDA-MB-231和MCF7细胞的DNA复制，抑制增殖；克隆形成实验显示相对于对照NC组，miR-7-5p可显著抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成能力；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡显示，相对于对照NC组，miR-7-5p可将细胞阻滞于G0/G1期，且促进MDA-MB-231的凋亡；immunoblot结果显示miR-7-5p可显著抑制REGγ的蛋白水平，促进周期相关调节因子p21和p27在细胞里的集聚及caspase3蛋白剪切，从而阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。结论：过表达miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞的增殖，抑制细胞周期于G0/G1期，促进细胞凋亡，在人乳腺癌中扮演“抑癌基因”的角色。第四章REGγ在人乳腺癌中的功能机制目的：利用shRNA敲减REGγ的表达，评价REGγ在人乳腺癌细胞中的功能，进一步验证miR-7-5p靶向REGγ的功能性。方法：通过shREGγ敲减MDA-MB-231细胞中REGγ的表达，利用real-timePCR检测REGγ敲减效果，进而评价REGγ的敲减对人乳腺癌细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡的调节作用。CCK8、平板克隆实验以及软琼脂克隆实验用来验证细胞增殖能力；流式细胞术用来检测细胞周期和细胞凋亡。结果：Real-timePCR结果显示shREGγ可显著降低MDA-MB-231细胞中REGγ的表达水平；相对于空载体组，shREGγ可显著降低MDA-MB-231细胞的克隆形成能力，阻滞细胞于G0/G1期，促进细胞凋亡，主要引起p21在细胞中的集聚及caspase3的剪切。结论：敲减REGγ的表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖；miR-7-5p可通过与REGγ的3′UTR特异结合，抑制REGγ蛋白翻译，抑制人乳腺癌细胞的增殖。
【作者】石远；
【导师】任国胜；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】乳腺癌；REGγ；表达；miR-7-5p；荧光素酶；增殖；细胞周期；干扰RNA；

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