结核性脑膜炎的潜在体液生物标志物研究

【摘要】背景结核性脑膜炎（Tuberculousmeningitis,TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）引起的中枢神经系统感染性疾病，约占结核病的7～10%，是以脑膜、大脑实质受损为主，并可波及脊髓、脊膜的非化脓性炎症。近年来由于人口流动频繁、免疫抑制剂广泛应用、耐药性结核菌株的出现及人免疫缺陷病毒的流行，TBM发病率有逐渐增高的趋势。而TBM的防治和诊疗过程中，早期准确的诊断与预后和治疗效果紧密相关联，因此准确有效的诊断方法在防治TBM中仍是当今亟待解决的重要医学问题。当前TBM的诊断主要依靠脑脊液（CSF）细胞、生化等检查。然而在TBM发生早期，CSF细胞学、生化变化多不典型，早期TBM诊断十分困难。本实验拟采用iTRAQ标记结合液相色谱串联质谱(iTRAQ—LC—MS／MS)的定量蛋白组学研究策略，比较TBM患者和健康对照CSF蛋白质表型，鉴定出TBM相关的差异蛋白质，为探讨TBM病理生理机制和筛选潜在诊断标志物提供新的证据。TBM常伴有血脑屏障的破坏，这使得TBM相关的代谢分子极易从CSF扩散至外周血液，提示检测TBM血液的代谢改变有望发现其潜在诊断标志物。本实验拟采用核磁共振（NMR）的代谢组学方法，筛选出TBM的潜在血液诊断标志物。目的1.采用iTRAQ的定量蛋白组学技术，分析TBM和正常的脑脊液蛋白质改变、筛选并验证TBM的潜在CSF蛋白质诊断标志物；2.采用核磁共振（NMR）的代谢组学方法，比较结核性脑膜炎患者与正常对照的血浆代谢谱，筛选TBM的潜在血浆代谢诊断标志物。方法1.第一部分：通过iTRAQ标记蛋白组学方法，比较TBM疾病组（n=12）和正常对照(n=12)脑脊液蛋白谱，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定TBM相关的脑脊液差异蛋白，通过生物信息学分析对差异蛋白进行功能注释和通路分析。进一步将筛选出的潜在的生物标志物蛋白进行WB验证，并构建诊断模型进行诊断效能评估。2.第二部分：采用核磁共振（NMR）的代谢组学方法，比较结核性脑膜炎患者与正常对照的血浆代谢谱，筛选出结核性脑膜炎患者相对于健康对照者的血浆差异代谢物；分析差异代谢物的分子功能，初步探讨这些血浆差异代谢物在结核性脑膜炎发病中的潜在作用。结果１．使用iTRAQ定量蛋白质组学技术鉴别出81例差异蛋白质，对这部分蛋白质进行生物信息学分析，结果显示这些蛋白质的功能主要与凝血级联反应，炎症反应，细胞粘附密切相关。WB蛋白印迹实验验证结果指出NELL2水平在TBM疾病组相对于健康对照组呈现显著下降。ROC曲线分析结果提示NELL2的诊断效能：83.3%的敏感性和75%的特异性。该结果提示NELL2是TBM具有良好诊断效能的潜在生物标志物。２．采用核磁共振（NMR）偶联OPLS-DA的统计方法鉴定出TBM血浆相对于正常对照中的差异代谢物如下：有24个血浆差异代谢物质在结核性脑膜炎组与正常组区分中起主要作用（VIP>1.0）。N-乙酰糖蛋白（N-acetylglycoprotein）、丙酮酸盐(Pyruvate)、葡萄糖（Glucose）、烟酰胺（Nicotinamide）、1-甲基组氨酸（1-Methylhistidine）、葡萄糖-内酯（Glucono-delta-lactone）在结核性脑膜炎中的表达量增高；低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）、脂质（Lipid）、异亮氨酸（Isoleucine）、亮氨酸（Leucine）、缬氨酸（Valine）、谷氨酸（Glutamine）、蛋氨酸（Methoinine）、组氨酸（Histidine）、3-羟基丁酸酯（3-Hydroxybutyrate）、乙酸（Acetate）、丙酮(Acetone)、乙醇（Ethanol）、磷酸胆碱（PC）、甘油磷酸胆碱（GPC）、乙酰乙酸（Acetoacetate）、谷氨酰胺（Glutamate）、N-甲基烟酰胺（N-Methylnicotinamide）在结核性脑膜炎中的表达量降低。四种生物标志物N-乙酰糖蛋白（N-acetylglycoprotein）、烟酰胺（Nicotinamide）、葡萄糖（α-Glucose，β-Glucose）经二元LogisticalRegression分析，在训练集中可区分结核性脑膜炎患者与正常对照，AUC值为0.810。在测试集中，这四种生物标志物可区分12例结核性脑膜炎患者与13例正常对照，AUC值为0.827。在病毒性脑膜炎与结核性脑膜炎训练集中，这四种生物标志物的AUC值为0.782。结论1.NELL2可作为TBM潜在的生物标志物。2.通过TBM患者血浆的代谢组学分析，我们鉴定出TBM相关的血浆差异代谢物质。分析这些差异代谢物质的分子功能，并采用独立样本验证相关差异代谢物的临床诊断价值，为寻找TBM的客观诊断方法提供了候选标志物。
【作者】魏有东；
【导师】谢鹏；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】结核性脑膜炎；生物标志物；iTRAQ；蛋白质组学；代谢组学；

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