p38和ERK1/2 MAPK通路在BMP9诱导人牙周膜干细胞成骨分化中的作用研究

【摘要】第一部分hPDLSCs的分离培养及纯化鉴定目的：从人牙周膜中分离出PDLSCs，并完成鉴定。方法：收集因正畸治疗而拔除的牙周健康且无龋的前磨牙，用手术刀刮离牙根中段的牙周膜组织，I型胶原酶和DispaseII消化1小时，利用70μm滤网过滤获得单细胞悬液，接种后采用克隆环筛选单细胞克隆，进行传代培养，通过克隆形成实验检测其克隆形成能力、免疫细胞化学染色检测间充质干细胞表型标志（STRO-1和CD146）以及诱导成骨向和成脂向分化能力检测等，完成对hPDLSCs的鉴定。结果：通过单克隆筛选获得的hPDLSCs呈典型的长梭形纺锤状；细胞克隆形成率为42%；免疫细胞化学染色显示波形蛋白(Vim)表达为阳性，而角蛋白(CK)则表达为阴性，间充质干细胞表型标志物（STRO-1和CD146）表达均为阳性；通过成骨及成脂向诱导，hPDLSCs可以分化为成骨细胞以及成脂细胞。结论：通过克隆筛选所获得的细胞经过形态评估、克隆形成能力、表达间充质干细胞标志物以及具有多向分化特点等几方面鉴定为hPDLSCs，为后续实验研究准备了细胞学基础。第二部分BMP9诱导hPDLSCs成骨向分化目的：检测BMP9对hPDLSCs的成骨诱导分化能力。方法：测定Ad-BMP9及Ad-GFP的感染滴度后，通过Ad-BMP9和Ad-GFP感染hPDLSCs，在感染后不同时间点通过ALP活性测定与染色、qPCR、钙盐沉积实验等手段检测ALP、OPN、OCN的表达以及钙盐形成能力。结果：Ad-BMP9作用下，ALP活性明显高于Ad-GFP组和空白组（p<0.01），在第7天达到最高峰，ALP染色结果也与之吻合；OPN和OCN的表达水平随着时间延长明显增高，与Ad-GFP组之间具有显著性差异（p<0.01）；钙盐沉积实验也显示Ad-BMP9组基质矿化强于Ad-GFP组。结论：分别从Ad-BMP9感染hPDLSCs后早、中、晚期成骨标志的分析确认了BMP9对hPDLSCs具有诱导成骨分化能力。第三部分BMP9诱导hPDLSCs成骨分化中p38MAPK通路的研究目的：分析p38MAPK通路是否参与BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程及其调节效应。方法：在Ad-BMP9感染hPDLSCs后36h，通过western-blot分析MKK3/6与p38的总蛋白及磷酸化蛋白（p-MKK3/6,p-p38）水平，确认其是否参与该分化过程；在Ad-BMP9感染hPDLSCs过程中加入p38抑制剂SB203580，分别通过定量分析与染色检测ALP的活性(7d)、qPCR及ELISA检测OPN和OCN的表达(10d)以及钙盐沉积实验(21d)，分析其调节效应。结果：Western-blot发现MKK3/6与p38总蛋白表达无显著改变，而p-MKK3/6与p-p38则明显升高；在Ad-BMP9感染hPDLSCs过程中加入SB203580后7天发现ALP表达水平明显降低（p<0.01），呈剂量依耐性，10μmol/L的SB203580抑制效果最明显；第10天qPCR检测OPN和OCN表达发现二者表达量明显降低（p<0.01），ELISA也有类似结果（p<0.05）；钙盐沉积实验也证实SB203580组基质矿化减弱。结论：MKK3/6与p38总蛋白无改变而磷酸化水平升高说明MKK3/6-p38信号通路参与了BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程，而且在加入SB203580后，早、中、晚期成骨指标均下调，进一步证实MKK3/6-p38信号通路对该成骨分化过程具有正向调节作用。第四部分BMP9诱导hPDLSCs成骨分化中ERK1/2通路的研究目的：分析ERK1/2通路是否参与BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程及其调节效应。方法：在Ad-BMP9感染hPDLSCs后36h，通过western-blot分析MEK1/2与ERK1/2的总蛋白及磷酸化蛋白（p-MEK1/2，p-ERK1/2）水平，确认其是否参与该分化过程；在Ad-BMP9感染hPDLSCs过程中加入ERK1/2抑制剂PD98059，分别通过定量分析与染色检测ALP的活性(7d)、qPCR及ELISA检测OPN和OCN表达(10d)以及钙盐沉积实验(21d)，分析其调节效应。结果：Western-blot发现MEK1/2与ERK1/2总蛋白表达无显著变化，而p-MEK1/2与p-ERK1/2则明显升高；在Ad-BMP9感染hPDLSCs过程中加入PD98059后7天发现ALP表达水平明显增高（p<0.01），25μmol/L的PD98059促进效果最明显；第10天qPCR及ELISA检测OPN和OCN表达发现二者表达量明显增高(p<0.05）；钙盐沉积实验也证实PD98059组基质矿化增强。结论：MEK1/2与ERK1/2总蛋白无改变而磷酸化水平升高说明MEK1/2-ERK1/2通路参与了BMP9诱导hPDLSCs成骨分化过程，而且在加入PD98059后，早、中、晚期成骨指标均上调，进一步证实MEK1/2-ERK1/2通路对该成骨分化过程具有负向调节作用。
【作者】叶国；
【导师】翁亚光；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】牙周膜；单克隆筛选；hPDLSCs；BMP9；成骨分化；MKK3/6；p38MAPK；MEK1/2；ERK1/2；

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