肺炎链球菌7价结合疫苗免疫抑制实验性哮喘的作用及机制研究

【摘要】背景和目的支气管哮喘(哮喘，asthma)是最常见的慢性气道炎症性疾病，其发病率呈持续上升趋势。目前临床干预哮喘的方法都只能控制哮喘症状，人们一直在努力寻找有效的哮喘防治方法。研究表明CpG-ODNs、BCG可以抑制小鼠模型的过敏性气道炎症，然而CpG-ODN治疗可以引起有害的副作用，BCG在人类的研究中对过敏性哮喘无效。肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原，可以引起肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症。流行病学研究发现肺炎链球菌7价结合疫苗（PCV7）可以减少儿童及成人哮喘的发病率及相关住院率。也有研究表明该疫苗在成年期小鼠免疫可以通过促进Treg和抑制Th2细胞的产生抑制哮喘的特征性表现。目前PCV7用于婴儿期免疫预防儿童肺炎链球菌感染，是否婴儿期PCV7免疫可以改变成年早期实验性哮喘CD4+T细胞亚类及抑制变应性气道炎症还不清楚。树突状细胞（DCs）是专职抗原呈递细胞，能激活初始CD4+T细胞，既诱导免疫反应，又参与免疫耐受，这与DCs功能状态有关，调节DCs功能状态有助于治疗和预防哮喘。髓样DCs在IL-4、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导下形成不成熟DCs，经抗原刺激后变为成熟DCs，表达高水平CD80、CD86、CD40等共刺激分子。我们前期研究发现疫苗BCG能诱导DCs部分成熟，部分成熟DCs促进Treg表达增加参与免疫耐受。提示DCs可能参与了PCV7抗哮喘的免疫调节。本研究旨在探讨婴儿期PCV7免疫对成年早期实验性哮喘的影响及作用机制，为哮喘防治提供新的干预思路。第一部分婴儿期PCV7免疫对成年早期实验性哮喘小鼠气道炎症、CD4+T细胞亚类的影响背景：肺炎链球菌是儿童社区获得性呼吸道感染的第一位细菌病原体，WHO推荐儿童接种PCV7预防肺炎链球菌疾病，PCV7能明显减少儿童哮喘发作次数、减轻哮喘严重程度，PCV7能预防哮喘。该疫苗在成年期小鼠免疫可以通过促进Treg的产生和抑制Th2细胞的产生抑制哮喘的特征性表现。目前PCV7用于婴儿期免疫预防儿童肺炎链球菌感染，是否婴儿期PCV7免疫可以改变成年早期CD4+T细胞亚类及抑制过敏性气道炎症还不清楚。因此本研究探讨婴儿期PCV7免疫对成年早期实验性哮喘小鼠气道炎症及CD4+T细胞亚类的影响，为后期研究奠定基础。目的：探讨婴儿期PCV7免疫对成年早期实验性哮喘小鼠气道炎症及CD4+T细胞亚类的影响。方法：清洁级3周BALB/c小鼠随机分为对照组（Control组）、PCV7免疫实验性哮喘组（PCV7+OVA组）、实验性哮喘组（OVA组），PCV7+OVA组3周时鼻腔滴注PCV7，PCV7+OVA组及OVA组用OVA（卵清蛋白）致敏与激发。小鼠肺功能仪测定小鼠气道高反应性；HE染色观察小鼠气道及肺组织病理变化；光学显微镜观察小鼠支气管肺泡灌洗液白细胞分类计数；ELISA检测BALF中INF-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β及IL-10；流式细胞术检测CD4+Th细胞各亚群表达情况。结果：PCV7+OVA组小鼠哮喘症状较OVA组减轻；气道高反应性显著低于OVA组小鼠；气道炎症较OVA组明显减轻。PCV7+OVA组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞较OVA组明显减少，PCV7+OVA组BALF中IL-13、IL-17A显著低于OVA组，而IFN-γ、IL-10显著高于OVA组，PCV7+OVA组纵隔淋巴结CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+INF-γ+T细胞显著高于OVA组，而CD4+IL-4+T、CD4+IL-17+T细胞显著低于OVA组。结论：婴儿期PCV7免疫是预防成年早期BALB/c小鼠实验性哮喘的有效方法。第二部分PCV7免疫对DCS影响的机制研究背景：婴儿期PCV7免疫可以促进CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th1细胞产生，抑制Th2、Th17细胞产生，用于预防成年早期哮喘，但其机制尚不清楚。树突状细胞（DCs）是专职抗原呈递细胞，能激活初始CD4+T细胞，既诱导免疫反应，又参与免疫耐受，这与DCs功能状态有关，调节DCs功能状态有助于治疗和预防哮喘。髓样DCs在IL-4、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导下形成不成熟DCs，经抗原刺激后变为成熟DCs，表达高水平MHCⅡ和CD80、CD86、CD40等共刺激分子。DCs摄取PCV7后如果共刺激分子的表达能够降低处于未成熟或部分成熟状态即可参与免疫耐受的调节，从而预防和治疗哮喘。本部分从体内和体外两个方面研究PCV7对DCs成熟度的影响，旨在探讨婴儿期PCV7免疫预防成年早期哮喘的可能发生机制，为哮喘防治提供新的干预思路。目的：研究体内和体外PCV7对DCs的影响，探讨PCV7预防哮喘的可能发生机制。方法：清洁级3周BALB/c小鼠分为对照组（Control组）、PCV7免疫实验性哮喘组（PCV7+OVA组）、实验性哮喘组（OVA组），PCV7+OVA组3周时鼻腔滴注PCV7，PCV7+OVA组及OVA组用OVA（卵清蛋白）致敏与激发。流式细胞术检测小鼠肺MHC-Ⅱ,CD40,CD80,CD86和纵隔淋巴结（MLN）MHC-Ⅱ,CD40,CD80,CD86的表达。ELISA检测BALF中INF-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β及IL-10；BALB/c小鼠4周处死，分离得到骨髓单个核细胞，经GM-CSF和IL-4刺激得到骨髓来源的DCs，培养至第7天，阴性对照组加PBS，PCV7组加PCV7，阳性对照OVA组加OVA刺激DCs成熟，培养至第9天，收集未贴壁细胞用于形态学鉴定、流式细胞术分析，细胞上清用于ELISA检测。结果：PCV7+OVA组小鼠肺MHC-Ⅱ,CD40,CD86和纵隔淋巴结MHC-Ⅱ,CD40,CD86,CD80的表达较OVA组明显降低。PCV7+OVA组BALF中IL-13、IL-17A显著低于OVA组，而IFN-γ、IL-10显著高于OVA组；PCV7刺激DCs形态与OVA刺激DCs比较呈不成熟状态，PCV7刺激DCsMHC-Ⅱ,CD40,CD86表达较OVA刺激DCs明显降低，PCV7刺激DCs培养上清中细胞因子IL-12p70、IL-6较OVA刺激DCs明显降低，而TGF-β较OVA刺激DCs明显升高。结论：婴儿期PCV7免疫预防成年早期哮喘的可能机制是抑制DCs成熟增加Treg表达。
【作者】张丽群；
【导师】符州；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】婴儿期PCV7免疫；实验性哮喘；成年早期；Th2；Th17；Foxp3+Treg；不成熟DCs；成年早期哮喘；

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