皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的机制及有效性安全性研究

【摘要】宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的身心健康。宫颈癌现有的治疗方式已经比较成熟，然而都不同程度的影响了患者的生育能力或正常组织器官的功能。近年来，宫颈癌患者的发病年龄逐渐出现年轻化趋势，而年轻患者保留生育功能的愿望更为迫切。因此，寻求更多可抑制或杀伤肿瘤，同时减少创伤的治疗手段成为目前宫颈癌治疗的研究热点。脉冲电场(PulsedElectricFields,PEF)的出现备受生物医学领域学者的关注。前期研究表明，当微秒级和纳秒级脉冲电场作用于肿瘤细胞后，可以产生协同化疗药物杀伤肿瘤细胞的生物学效应，甚至可以直接杀伤肿瘤细胞，为肿瘤应用脉冲电场治疗奠定了基础。然而，微秒级和纳秒级的脉冲电场在治疗肿瘤时，需通过电极针为载体才能达到治疗部位发挥作用。这种方法在一定程度上限制了脉冲电场在临床的应用。如果脉冲电场可以克服这个缺点，能无创引导进入患者体内，那么脉冲电场在临床的应用才能更为广泛和可行。因此，具有穿透性及靶向性的皮秒脉冲电场（Picosecondpulsedelectricfields，psPEF）本课题由国家自然科学基金面上项目(81172123)资助为肿瘤的治疗提供了新的思路，目前国内外关于psPEF治疗肿瘤的相关研究较少。根据脉冲电场对细胞作用的窗口效应及微秒脉冲的电穿孔效应和纳秒脉冲的细胞内处理效应，从理论上讲，脉宽较低的皮秒级脉冲电场对细胞的主要作用应该在细胞器水平，而线粒体和内质网等细胞器与细胞凋亡的发生密切相关。另外皮秒脉冲电场还具有以下优点：高时间分辨率、高空间分辨率、在传播过程中保持输入脉冲的冲激特性、在靶点区域具有很高的分辨率。匹配超宽带冲激脉冲辐射天线（Impulseradiatingantenna，IRA）所产生的皮秒脉冲电场可以向指定的范围传输能量，将脉冲电磁波汇聚于目标组织，甚至可以使靶点组织发生坏死。在传播过程中IRA的辐射能量在空间、时间上都很集中。如果能够利用IRA将皮秒脉冲电场输送进入肿瘤组织，便有可能实现肿瘤的无创治疗。本课题组在前期的研究中发现皮秒脉冲电场可诱发Hela细胞内线粒体膜电位变化，通过内质网应激途径活化caspases（Cysteine-containingaspartate-specificproteases，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类）依赖的细胞凋亡途径而诱导Hela细胞凋亡，而体内肿瘤细胞的活动受神经、体液等多方面因素的影响，因此，有必要在细胞学研究水平的基础上进行动物实验，进一步研究皮秒脉冲电场对宫颈癌模型动物在体肿瘤的治疗机制是否同样是诱导肿瘤细胞凋亡，并观察其治疗的有效性和安全性，研究结果对于其临床应用的进一步研究具有指导意义。本课题构建裸鼠宫颈癌动物模型作为在体实验的研究对象，以前期细胞实验为基础，对皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的机制及有效性安全性进行初步研究，目的是为皮秒脉冲电场治疗宫颈癌的可行性及进一步临床应用研究提供较为直接的依据。研究共分为三部分。第一部分皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型诱导凋亡机制的研究第一节裸鼠宫颈癌动物模型的构建目的：构建裸鼠宫颈癌荷瘤动物模型。方法：将制备好的Hela细胞悬液接种于裸鼠背部皮下,每鼠0.2ml。1周后可扪及皮下结节，大约需2周待肿瘤最大直径约0.5-0.8cm时,取肿瘤组织作移植瘤模型，约2周移植瘤直径达1.0cm左右。将成功移植肿瘤的荷瘤小鼠按实验设计要求分为对照组、治疗组。结果：成功建立人宫颈癌荷瘤动物模型。第二节皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型适宜参数的筛选目的：研究并筛选psPEF治疗宫颈癌荷瘤动物模型的适宜参数。方法：根据前期细胞实验结果及预实验结果设定参数并分为三个不同电压作用的实验组(50kV组，60kV组，70kV组)，固定参数为：脉冲个数2000个，脉宽800ps，频率3Hz。使用镊型电极无创传导皮秒脉冲电场治疗荷瘤动物模型，脉冲电场治疗后24h处死动物，取肿瘤组织，采用TTC染色法染色肿瘤组织，测量并计算坏死肿瘤组织体积。根据统计结果筛选适宜的治疗宫颈癌动物模型的皮秒脉冲电场参数。结果：皮秒脉冲电场治疗荷瘤动物模型肿瘤组织后，通过TTC染色法，可观察到随着电压的增高，肿瘤组织呈苍白色的区域逐渐增大。统计结果表明各电压组坏死组织长径、宽径均无统计学差异；50kV组与60kV组坏死组织的厚度无差异；50kV组与70kV组坏死组织的厚度相比较有统计学差异(P<0.05)；三组之间坏死组织体积相比较均有显著统计学差异(P<0.01)。结论：皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型后，随着电压增高，肿瘤组织的坏死程度逐渐加重。因此，皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的适宜参数为：脉冲个数2000个、脉宽800ps、频率3Hz、电压70kV。第三节皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型诱导凋亡机制的研究目的：观察皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的诱导凋亡效应，初步探讨其诱导凋亡的机理。方法：将宫颈癌动物模型分为四个组，即对照组和治疗组(脉冲治疗后6h组、脉冲治疗后12h组、脉冲治疗后24h组)，固定参数为：脉冲个数2000个，脉宽800ps，电压70kV，频率3Hz。使用镊型电极无创传导皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型。应用HE染色法观察肿瘤组织细胞形态学变化。采用透射电子显微镜观察对照组和治疗组肿瘤组织细胞的超微结构。TUNEL试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡率；激光共聚焦显微镜观察肿瘤组织线粒体的跨膜电位变化；采用caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性测定试剂盒分别测定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12的活性。结果：组织细胞形态学结果显示对照组肿瘤组织无明显细胞坏死，而治疗组均有细胞坏死，且随治疗后时间的延长坏死程度逐渐加重。透射电子显微镜观察结果显示对照组肿瘤细胞表现出轻微的线粒体肿胀，而治疗后6h组肿瘤细胞出现早期凝固性坏死，治疗后12h组出现显著的凝固性坏死和多个凋亡小体，治疗后24h组出现更为显著的凝固性坏死和少量凋亡小体。TUNEL检测肿瘤组织的细胞凋亡率结果表明，与对照组相比，各治疗组的肿瘤细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，治疗后12h组的细胞凋亡率显著高于其他治疗组(P<0.01)，治疗后6h组与治疗后24h组相比较无统计学差异。激光共聚焦显微镜下观察各组线粒体跨膜电位的结果表明，从对照组到治疗后6h组、治疗后12h组，红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强，但是治疗后24h组两种荧光均明显减弱。试剂盒测定caspase-3，caspase-8，caspase-9，caspase-12活性结果显示，治疗组caspase-3和caspase-12的活性升高，各组caspase-3与caspase-12活性结果趋势相似，均为治疗后12h组>治疗后24h组>治疗后6h组=对照组，各组caspase-8和caspase-9活性无统计学差异。结论：psPEF可使用镊型电极引导至宫颈癌动物模型的肿瘤部位，杀伤肿瘤细胞，在此过程中线粒体膜电位下降及内质网应激途径激活诱导肿瘤细胞凋亡发挥了作用。第二部分皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的有效性研究目的：观察皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型后肿瘤体积的变化、相对肿瘤增殖率及生存曲线。方法：将宫颈癌动物模型分为对照组和治疗组，皮秒脉冲电场的参数为：脉冲个数2000个，脉宽800ps，频率3Hz，电压：70kV。使用镊型电极无创传导皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型。观察裸鼠精神状态及肿瘤组织的生长情况。每3天测量1次裸鼠的肿瘤体积。根据肿瘤体积测量的结果计算相对肿瘤增殖率。治疗组和对照组的动物模型在同等条件下饲养，自然生存并记录死亡时间，制作生存曲线。结果：对照组与治疗组肿瘤最早分别于第24天，第58天发生破溃。治疗组肿瘤体积在治疗后3天、6天、9天与对照组比较，经统计学分析有差异，12天以后无统计学差异。治疗组相对肿瘤增殖率在治疗后3天、6天、9天分别为76.87%、71%、68.87%。生存时间观察显示对照组为（41-92）天，治疗组为（70-118）天。两组荷瘤动物的生存曲线无统计学差异。结论：提示皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型肿瘤对其生长有抑制作用。但远期抑制效应不明显。第三部分皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的安全性研究第一节皮秒脉冲电场对宫颈癌动物模型肿瘤周围组织的影响目的：观察皮秒脉冲电场对宫颈癌动物模型肿瘤周围正常皮肤及皮下组织的影响。方法：将宫颈癌动物模型分为四个组，即对照组和治疗组(脉冲治疗后6h组、脉冲治疗后12h组、脉冲治疗后24h组)，固定参数为：脉冲个数2000个，脉宽800ps，电压70kV，频率3Hz。使用镊型电极无创传导皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型。取电极接触部位的动物皮肤及皮下组织，采用HE染色观察其组织细胞形态学变化，采用透射电子显微镜分别观察对照组和治疗组动物模型皮肤及皮下组织的超微结构，用DNAladder观察有无凋亡现象。结果：HE染色结果显示，对照组及治疗组的皮肤及皮下组织均无明显坏死。透射电子显微镜观察结果显示对照组及治疗组电极接触部位的皮肤表皮和真皮层结构均无破坏，未见坏死。治疗后6h组表皮纤维细胞结构正常，基底细胞线粒体轻度肿胀，血管内皮细胞正常。治疗后12h组表皮纤维细胞正常，胞膜、核膜完整，细胞内线粒体肿胀。治疗后24h组表皮结构正常，多泡脂肪细胞结构完整，血管结构正常，内皮细胞未见肿胀。对照组及治疗组未见DNAladder条带。结论：皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型后脉冲传导所经过的皮肤及皮下组织未见细胞凋亡、损伤与坏死。第二节皮秒脉冲电场治疗对宫颈癌动物模型重要脏器的影响目的：观察皮秒脉冲电场治疗对宫颈癌动物模型重要脏器的影响。方法：将宫颈癌动物模型分为对照组和治疗组，脉冲参数为：脉冲个数2000，脉宽800ps，频率3Hz，电压70kV。使用镊型电极无创传导皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型。脉冲治疗后24h，采血并取裸鼠的心脏、肝脏、肾脏。分别采用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、谷丙转氨酶(GPT)测定试剂盒、谷草转氨酶(GOT)测定试剂盒、尿素氮(BUN)测定试剂盒测定心脏、肝脏及肾脏功能。采用HE染色观察脉冲治疗后荷瘤动物心脏、肝脏及肾脏的组织细胞形态学变化。结果：皮秒脉冲电场治疗组宫颈癌动物模型的心功能血清学指标LDH，肝功能血清学指标GOT和GPT及肾功能血清学指标BUN活性与对照组相比较无统计学差异。HE染色显示治疗组荷瘤动物模型的心脏、肝脏、肾脏的组织细胞形态结构正常。结论：皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型后，裸鼠的心脏、肝脏、肾脏的功能及形态无明显改变，提示皮秒脉冲电场对裸鼠宫颈癌动物模型的重要脏器无影响。
【作者】贾佳；
【导师】熊正爱；
【作者基本信息】重庆医科大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】皮秒脉冲电场；宫颈癌动物模型；凋亡；有效性；安全性；

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