RB基因、Kras基因和P53基因的异常与iMEF细胞成骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系

【摘要】研究背景和目的骨肉瘤是一种起源于骨间叶组织的恶性肿瘤，占原发恶性骨肿瘤的20%，约70%-80%的患者发病年龄在10-25岁，年发病率约为(1-3)/100万人。典型的骨肉瘤好发于长管状骨干骺端，通常预后不佳。患者起病时无典型临床症状，仅为局部疼痛和肿胀，有时伴关节功能障碍，极少数以病理性骨折就诊，容易与外伤或生长痛混淆，恶性程度高，早期有可能发生肺转移，约有10-20%的病人在诊断时发现有转移灶，预后极差。20世纪70年代以前，主要是以截肢手术为主要的治疗方式，但是随着化疗药物的使用，骨肉瘤病人的5年生存率有所提高。近30年来，尽管人们尝试用新的化疗药物或联合用药，病人的生存率不再提高，因此，阐明骨肉瘤发病的分子机制对于提高病人的生存率至关重要。迄今为止，骨肉瘤发病的分子机制尚未阐明。细胞遗传学对骨肉瘤的研究显示多种肿瘤抑癌基因的失活以及癌基因的过表达是骨肉瘤发病的重要原因。其中，RB基因、P53基因以及Kras基因与骨肉瘤的发生密切相关。有证据表明，RB基因、P53基因缺失可阻碍干细胞向成骨细胞分化的过程，而有观点认为骨肉瘤是干细胞向成骨分化障碍性疾病。以下证据表明RB基因在成骨分化中起着重要的作用：1）某些病毒蛋白可以结合RB从而抑制成骨分化：例如在成骨细胞中通过SV40大T抗原对其进行永生化后，可能抑制成骨细胞的分化，腺病毒E1A12S蛋白通过RB结合域抑制分化，2）在RB缺失的SaoS2细胞中重新表达RB，细胞出现了衰老表型。成骨分化同样需要P53基因的参与：1）P53缺失促进裸鼠成骨细胞的分化，骨密度增高。2）P53抑制基因MDM2的敲除则致P53高表达和骨特异性的转录因子RUNX2的水平被抑制。3）在间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)中，P53基因的敲除促进早期成骨分化而抑制晚期分化。鉴于上述实验结果的支持，本实验分别构建了RB、P53敲除的细胞模型，试图探讨这两种基因的缺失与骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。Kras是一种癌基因，多种文献报道骨肉瘤中Kras的表达增高。但是它对骨分化是否存在影响目前尚未见报道，本实验试图探讨Kras过表达与骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。骨形态发生蛋白9（Bonemorphogeneticprotein,BMP9）是MSC成骨分化的强诱导因子，本文的实验研究对象是永生化的裸鼠胚胎成纤维干细胞(iMEF,immortalizedMouseEmbryonicFibroblasts)，它在BMP9诱导下能够进行正常的成骨分化；但是，当RB基因、P53基因以及Kras基因在iMEF中异常表达是否影响iMEF细胞正常的成骨分化，从而导致骨肉瘤的产生？本课题的目的是探讨这些基因的异常表达与iMEF细胞成骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。鉴于骨肉瘤是干细胞分化障碍所引起的疾病，因此，探讨RB、P53和Kras基因的异常与骨分化障碍及骨肉瘤发生之间的关系对于阐明骨肉瘤的发病机制具有重要的意义。研究主要内容：(1)探讨RB基因的缺失与iMEF细胞成骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。(2)探讨RB基因缺失或存在联合Kras基因过表达与iMEF细胞成骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。(3)探讨P53基因的缺失联合Kras基因过表达与iMEF细胞成骨分化障碍及骨肉瘤发生的关系。实验方法1.构建iMEFRBfl/fl细胞：将RBfl/fl转基因裸鼠作为实验对象，待其怀孕13.5天，取其胎鼠制备成原代MEFRBfl/fl细胞，之后用逆转录病毒将其永生化，获得iMEFRBfl/fl细胞。2.获取iMEFRB-/-细胞：用AdR-CRE感染iMEFRBfl/fl细胞，以敲除其RB基因，再克隆化，（已敲除RB基因的iMEF细胞），并对其进行功能鉴定：(1)通过RT-PCR扩增RB基因，选取RB基因已被敲除的克隆，得到iMEFRB-/-细胞；(2)iMEFRB-/-是否还保有MSC的成骨成脂分化的能力：用MTT鉴定iMEFRB-/-单克隆细胞的增殖能力；用碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色及活性测定、OilRedO染色来判断iMEFRB-/-单克隆是否具有成骨、成脂能力。通过在iMEF细胞中确定RB基因是否被敲除及细胞是否保留MSC成骨成脂能力来鉴定iMEFRB-/-是否构建成功。3.运用Piggybac系统构建分别携带RB和Kras基因的质粒pMPN-RB、pMPB5-Kras。4.构建并鉴定稳定表达RB、Kras基因的细胞系：提取质粒pMPN-RB、pMPB5-Kras，转染至相应的目的细胞中，针对不同的质粒加入不同的抗生素进行筛选：对pMPB5-Kras选用blasticidinS(BSD)、对pMPN-RB选用G418，其中BSD筛选5天，G418筛选14天，撤药挑选单克隆，对克隆化的细胞进行扩增，再用RT-PCR检测RB和Kras的表达。5.诱导iMEF细胞分化：(1)扩增腺病毒Ad-GFP、Ad-BMP9、Ad-RFP和AdR-CRE。(2)腺病毒Ad-BMP9诱导iMEF细胞分化：接种iMEF细胞，待细胞贴壁后，分别加入一定数量的Ad-BMP9，感染效率约在30%左右，6小时后换液；对照组用Ad-GFP。6.分化能力的检测(1)成骨能力检测：将Ad-BMP9诱导分化后的iMEF细胞培养后通过下述指标鉴定成骨能力；对照组用Ad-GFP。a.ALP检测：将诱导分化后的iMEF细胞培养7天，通过ALP活性测定以及ALP染色来检测ALP的表达。b.钙盐沉积：将诱导分化后的iMEF细胞培养14天左右，通过AlizarinRedS染色检测钙盐沉积。(2)成脂能力检测：将Ad-BMP9诱导分化后的iMEF细胞培养14天左右后通过OilRedO染色鉴定其成脂能力；对照组用Ad-GFP。7.裸鼠皮下和肌肉的成骨或成瘤实验a.实验细胞的准备：接种iMEF细胞至100mmDish中，用含10％FBS的DMEM培养基培养，分别加入Ad-GFP、AdBMP9（感染效率约为30%）；感染24h后用胰酶将细胞消化，PBS洗涤1-2次后，收集细胞，用100μlPBS重悬后接种。b.皮下和肌肉接种：取雌性4周龄BALB/C裸鼠，每只裸鼠后肢背侧每个接种点接种100μl细胞悬液，约1×106个细胞。每只裸鼠在双侧肢肩胛骨侧皮下、双侧臀部皮下、双侧大腿肌肉分别接种细胞。定期观察裸鼠的状态、裸鼠皮下和肌肉注射位点是否有破溃、皮下包块的生长速度的快慢、裸鼠是否有死亡。c.剥离包块：在裸鼠接种细胞一个月后，二氧化碳处死后断颈，剥离并摘取包块组织，再置于含有脱钙液的福尔马林中脱钙、固定，约2-3天后对其进行石蜡包埋、切片、染色等处理。8.切片染色和镜下组织学形态观察：对病理切片分别进行HE、Masson’strichrome染色，并进行组织学观察、病理学诊断。实验结果1.成功建立RB基因敲除的iMEF细胞模型将RBfl/fl转基因裸鼠作为实验对象，待其怀孕13.5天时，将其胚胎制备成原代MEFRBfl/fl细胞后，用本实验室构建的逆转录病毒SSR41＃对其进行永生化，得到iMEFRBfl/fl细胞。之后用AdR-CRE病毒感染iMEFRBfl/fl细胞，以敲除RB基因。挑取细胞单克隆，首先用RT-PCR鉴定RB的表达，结果显示7个克隆（iMEFRB-/-26＃,iMEFRB-/-31＃,iMEFRB-/-38＃,iMEFRB-/-40＃,iMEFRB-/-45＃,iMEFRB-/-54＃和iMEFRB-/-59＃）的RB基因敲除成功；再用MTT法来检测这些克隆的增殖能力，结果显示：与对照组iMEFRBfl/fl相比较，克隆iMEFRB-/-26＃、iMEFRB-/-54＃第4、第5天细胞增殖能力明显增高，第四天的值分别是对照组的1.55（p<0.05)、1.43倍（p<0.05)，第五天的值分别是对照组的1.55（p<0.05)、1.38倍（p<0.05)。初步提示我们成功建立了RB基因敲除的iMEF细胞模型。2.iMEFRBfl/fl细胞保留干细胞成骨成脂分化能力；敲除RB基因后，iMEF细胞成骨分化障碍，成脂分化能力增强将PCR鉴定后的7个iMEFRB-/-单克隆，选取6个进行成骨、成脂能力的检测，对iMEFRB-/-单克隆进行ALP染色、ALP活性测定和OilRedO染色，实验结果显示：与对照克隆iMEFRBfl/fl相比较，6个克隆（iMEFRB-/-26＃,iMEFRB-/-31＃,iMEFRB-/-38＃,iMEFRB-/-40＃,iMEFRB-/-45＃和iMEFRB-/-54＃）的ALP染色均有不同程度的变浅，ALP活性测定值也有不同程度的下降，但是OilRedO染色则有不同程度的增加。其中，iMEFRB-/-26＃和iMEFRB-/-54＃ALP活性下降最明显，其活性值分别为65530±19067、64215±7673，较对照组iMEFRBfl/fl分别下降93%（p<0.001)、90%（p<0.001）。提示这些克隆的成骨能力有不同程度的下降，而成脂能力则有所增强。随后选取克隆iMEFRB-/-26＃、iMEFRB-/-54＃接种到裸鼠皮下和肌肉，实验结果显示：iMEFRB-/-26＃在裸鼠皮下未形成包块，iMEFRB-/-54＃形成的包块较对照组变小。肌肉组织的HE染色结果显示对照组iMEFRBfl/fl形成大量类骨样物质，而iMEFRB-/-26＃和iMEFRB-/-54＃组几乎未见类骨样物质形成，但可见大量的脂肪细胞形成。即对照组iMEFRBfl/fl细胞可使裸鼠成骨，而克隆iMEFRB-/-26＃不能成骨，iMEFRB-/-54＃的成骨能力减弱，两者的成脂能力均增强。提示敲除RB基因后iMEF细胞成骨分化障碍，成脂分化能力增强。综上所述，iMEFRBfl/fl细胞保留干细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化的能力，但是敲除RB基因后iMEF细胞成骨分化障碍，成脂分化能力增强。3.RB重新表达能够恢复iMEFRB-/-细胞的成骨能力将携带RB基因的表达载体pMPN-RB转染到iMEFRB-/-26＃和iMEFRB-/-54＃中，G418筛选得到稳定细胞系后，RT-PCR检测上述克隆中RB基因的表达，将恢复RB基因表达的细胞分别命名为iMEFRB-/-26＃/RB,iMEFRB-/-54＃/RB。我们发现这两个克隆重新表达RB基因后，iMEFRB-/-26＃/RB的ALP染色和AlizarinRedS染色均较iMEFRB-/-26＃明显变深，ALP活性测定值较iMEFRB-/-26＃明显增加。其中iMEFRB-/-26＃/RBALP活性测定值为627074±62005，是对照组iMEFRB-/-26＃的9.6倍（P<0.001)；iMEFRB-/-54＃/RB的ALP染色和AlizarinRedS染色较iMEFRB-/-54＃明显变深，ALP活性测定值较iMEFRB-/-54＃明显增加。其中iMEFRB-/-54＃/RBALP活性测定值为355443±73014，是对照组iMEFRB-/-54＃的5.5倍（P<0.001)。但这两个克隆的成脂能力并无明显变化。我们用成骨能力恢复较好的iMEFRB-/-26＃/RB来进行体内实验，观察其在裸鼠皮下成骨能力是否得以恢复。实验结果表明，当RB在克隆iMEFRB-/-26＃中重新表达时，其成骨能力得到恢复，HE染色可见iMEFRB-/-26＃/RB在裸鼠肌肉中形成了明显的类骨样物质，而iMEFRB-/-26＃未能在裸鼠肌肉中成骨样物质。这说明将RB重新表达于iMEFRB-/-细胞成功，同时iMEFRB-/-26＃/RB成骨能力也得以恢复。但是，单个克隆并不能代表整体的细胞特性，因此将所获得的RB敲除的所有iMEF克隆混合在一起，命名为iMEFRB-/-pool，鉴定iMEFRB-/-pool向成骨细胞、成脂细胞分化的能力，以及将RB重新表达于iMEFRB-/-pool中成骨能力恢复情况。体外实验结果显示，iMEFRB-/-pool＃/RB的ALP染色和AlizarinRedS染色均较iMEFRB-/-pool明显变深，ALP活性测定值较iMEFRB-/-pool明显增加。其中，iMEFRB-/-pool/RB活性测定值为643013±48037，约为对照组iMEFRB-/-pool的8.9倍（P<0.001)。与体外实验一致的是，其体内实验所获取的组织块HE染色显示iMEFRB-/-pool/RB组形成了明显的类骨样物质，Masson’sTrichrome染色显示iMEFRB-/-pool/RB组形成了大量红色的胶原物质，而iMEFRB-/-pool在体内成骨障碍，这说明将RB重新表达于iMEFRB-/-pool细胞成功，并且iMEFRB-/-pool/RB成骨能力恢复。4.RB基因缺失联合Kras过表达致iMEF成骨分化障碍，并形成纤维肉瘤将携带Kras基因的表达载体pMPB5-Kras转染到iMEFRB-/-26＃、iMEFRB-/-54＃中，BSD筛选得到稳定细胞系后，RT-PCR检测上述克隆中的Kras基因的表达。将Kras基因过表达的细胞分别命名为iMEFRB-/-26＃/Kras和iMEFRB-/-54＃/Kras，观察其体外成骨能力。实验结果显示：iMEFRB-/-26＃/Kras和iMEFRB-/-54＃/Kras细胞的ALP活性测定值分别较对照组iMEFRB-/-26＃和iMEFRB-/-54＃降低，AlizarinRedS染色较对照组iMEFRB-/-26＃和iMEFRB-/-54＃变浅。其中，iMEFRB-/-26＃/Kras和iMEFRB-/-54＃/Kras的ALP活性测定值分别为84590±7100、67661±11836，与对照组iMEFRBfl/fl相比较，均下降90%（p<0.001)。与iMEFRB-/-54＃/Kras克隆相比较，iMEFRB-/-26＃/Kras体外成骨能力下降较为明显，因此使用该克隆来进行体内实验。结果：对照组iMEFRB-/-26＃在裸鼠皮下不能形成包块；而iMEFRB-/-26＃/Kras在裸鼠皮下形成纤维肉瘤，HE染色可见肿瘤组织致密、均匀，以成束和水流样，典型地排列成鲱骨样，细胞体积相对大，为梭形。细胞核丰满，着色深，多形性较小，不规则。同样，单个克隆不能反映整体的细胞特性，因此我们又将携带Kras基因的表达载体pMPB5-Kras转染到iMEFRB-/-pool（iMEFRB-/-pool/Kras），再进行实验。体外实验显示iMEFRB-/-pool/Kras的ALP染色、AlizarinRedS染色均较对照组iMEFRBfl/fl变浅。ALP活性测定值均较对照组iMEFRBfl/fl降低。其中，iMEFRB-/-pool/KrasALP活性测定值为59228±12904，与对照组相比较下降92%（p<0.001)。体内实验的组织切片经HE染色后，显示iMEFRB-/-pool/Kras在裸鼠皮下形成纤维肉瘤，肿瘤组织致密、均匀，以成束和水流样组织为特点，典型地排列成鲱骨样。细胞体积相对大，为梭形。细胞核丰满，着色深，多形性较小，不规则。为了进一步验证在RB基因缺失联合Kras基因过表达能够形成纤维肉瘤的结论，我们还构建了Kras过表达的iMEFRBfl/fl细胞，命名为iMEFRBfl/fl/Kras，用AdR-CRE病毒感染iMEFRBfl/fl/Kras，敲除RB基因后，观察能否与iMEFRB-/-pool/Kras形成相同表型。体内结果显示用AdR-CRE感染过的iMEFRBfl/fl/Kras在裸鼠皮下形成纤维肉瘤，HE染色结果显示：肿瘤组织较致密、均匀，成束和水流样地排列成鲱骨样。细胞体积相对大，为梭形。细胞核丰满，着色深，多形性较小，不规则。Masson’sTrichrome染色显示红色纤维组织中夹杂着少许淡蓝色的物质（这说明在AdR-CRE病毒处理的过程中，RB未完全去除，部分iMEF细胞还保有成骨能力，所以淡蓝色物质应该是未去除掉RB的iMEFRBfl/fl/Kras在BMP9的刺激下分化成为的未成熟骨）。该实验说明RB基因缺失联合Kras基因过表达可以形成纤维肉瘤。5.RB基因存在联合Kras基因过表达使iMEF成骨晚期分化障碍，形成骨肉瘤。将Kras过表达于iMEFRBfl/fl，体外实验结果显示与对照组iMEFRBfl/fl相比较，iMEFRBfl/fl/Kras的ALP活性略有下降，但无统计学意义（P>0.05)；AlizarinRedS染色较深，这说明iMEFRBfl/fl/Kras具有较强的成骨能力。HE染色结果显示癌组织由大小不等，异型性显著的癌细胞构成，可见肿瘤性类骨质形成。Masson’sTrichrome染色显示有散在的由肿瘤细胞产生的红色、蓝色胶原纤维。结合HE与Masson’sTrichrome染色的结果可以判断iMEFRBfl/fl/Kras在裸鼠皮下可以形成骨肉瘤。6.P53基因缺失或P53基因缺失联合Kras过表达均使iMEF成骨分化障碍，形成纤维肉瘤。体外实验结果表明：iMEFP53-/-和iMEFP53-/-/Kras的ALP染色紫色物质较少；其AlizarinRedS染色则几乎未见红色物质。其中，iMEFP53-/-ALP活性测定值是158430±6100，为iMEFP53-/-/Kras的2.1倍（P<0.05)，这说明在BMP9刺激下，iMEFP53-/-、iMEFP53-/-/Kras几乎未向成骨细胞分化，而iMEFP53-/-/Kras成骨能力较iMEFP53-/-弱。体内实验结果：MEFP53-/-和iMEFP53-/-/Kras的结果几乎相同，即HE染色显示胶原纤维稀少，排列成鲱骨样的特征性的束和水流样结构失去主导地位，而以细胞为主。细胞大，多形性明显。核着色过深，有异形性，偶有畸形或多个核。提示无论Kras过表达与否，iMEFP53-/-在裸鼠体内均形成纤维肉瘤。结论1.RB基因在iMEF细胞向成骨分化的过程中可能是必需的，RB基因单独丢失不能导致骨肉瘤的发生。2.RB基因缺失联合Kras过表达致iMEF成骨分化障碍，并形成纤维肉瘤；RB基因存在联合Kras基因过表达使iMEF成骨晚期分化障碍，形成骨肉瘤，这说明１）RB在Kras介导的iMEF向骨肉瘤恶性转化过程中可能是必需的；２）在干细胞分化异常导致骨肉瘤的过程的早期不能丢失RB。3.P53基因缺失或P53基因缺失联合Kras过表达均使iMEF成骨分化障碍，形成纤维肉瘤。说明Kras可能在P53基因缺失下介导的纤维肉瘤形成中不是关键因子。研究背景与目的骨肉瘤（Osteosarcoma，OS)是在成人和青少年中发病最常见的原发性骨源性恶性肿瘤，起源于骨间叶组织，占原发恶性骨肿瘤的20%，约70%-80%的患者发病年龄在10-25岁，年发病率约为(1-3)/100万人。典型的骨肉瘤好发于长管状骨干骺端，通常预后不佳。患者起病时无典型临床症状，仅为局部疼痛和肿胀，有时伴关节功能障碍，极少数以病理性骨折就诊，容易与外伤或生长痛混淆，恶性程度高，早期有可能发生肺转移，约有10-20%的病人在诊断时发现有肺转移灶，预后极差。20世纪70年代以前，主要是以截肢手术为主要的治疗方式，但是随着化疗药物的使用，骨肉瘤病人的5年生存率有所提高，但是近30年来，尽管人们尝试用新的化疗药物或联合用药、临床治疗手段越来越先进，病人的生存率没再提高，转移或复发患者的预后仍然较差。对于OS的发病机制目前研究尚不清楚。因此，阐明骨肉瘤发病的分子机制对于提高病人的生存率至关重要。S100蛋白家族是一类具有EF手型结构的分子，有21个成员，能与钙离子及其靶蛋白结合从而发挥多种生理功能：包括参与钙稳态、细胞增殖和分化、酶活性和转录因子的调节、蛋白质磷酸化等。其中15个成员的基因定位于人染色体lq21，该区段染色体稳定性差，易发生多种染色体重排和基因扩增。现已发现多个S100成员在肿瘤中表达异常，与肿瘤增殖、侵袭、转移和凋亡密切相关。S100A4是该家族成员之一，已有不少关于它参与肿瘤发生发展的研究报道。课题组前期发现S100A4在高侵袭性的MG63.2中的表达高于MG63，提示S100A4可能在调节骨肉瘤的发生发展中有着重要的作用。本文实验目的是为了探讨S100A4是否参与调节骨肉瘤（OS）的增殖和成骨分化，为阐明OS发生发展机制和寻找新的治疗措施积累实验依据。细胞株1.OS细胞系MG63、MG63.2(高侵袭性的MG63.2由实验室构建并保存)和143B。因这两株细胞具有高转移性，从而可以用来观察S100A4对调节OS细胞的增殖、凋亡以及分化中的作用。2.MSC：我们采用具有间充质干细胞特点的C3H10T1/2细胞系作为研究对象，观察S100A4对干细胞成骨分化的影响。研究方法1.逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR)检测OS细胞MG63、MG63.2中S100A2、S100A4、S100A6、S100A7和S100B基因的表达。比较上述S100基因在MG63和MG63.2表达后，选取这两株细胞中差异有明显变化的基因进行后续试验。2.以RT-PCR提示的在MG63和MG63.2中S100基因表达差异最明显的S100A4作为诱导因子。制备腺病毒Ad-S100A4和AdR-siS100A4，分别感染骨肉瘤143B细胞，通过RT-PCR和Westernblot检测143B中S100A4的表达。3.细胞增殖试验采用细胞倍增时间法测定。用Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP分别感染143B和MG63.2细胞，于第1、3、5、7天分别对上述两种细胞进行台盼蓝染色检测活细胞数目，计算各细胞倍增时间。4.细胞凋亡试验：流式细胞仪检测细胞凋亡。用Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP感染143B细胞，在1%血清中培养48小时后，碘化丙啶与膜联蛋白V双染后流式细胞仪检测143B细胞凋亡能力的改变。5.细胞侵袭和迁移试验：通过细胞划痕与transwell小室试验检测经Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP感染后的143B和MG63.2的细胞侵袭、迁移能力的改变。6.成骨指标的检测：用Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP感染MG63.2及C3H10T1/2后，检测C3H10T1/2细胞的ALP活性的变化；免疫组织化学染色检测MG63.2的成骨晚期指标OPN、OCN的变化。结果1.MG63.2细胞中S100A4基因表达水平高于MG63细胞通过RT-PCR的方法检测MG63和MG63.2中内源性S100A2、S100A4、S100A6、S100A7以及S100B的基因表达水平。结果显示，除S100A7外，其余四种S100基因均在这两种细胞中表达，其中仅S100A4基因在MG63.2中的表达较MG63增高。2.沉默S100A4基因的表达可抑制OS细胞的增殖分别用Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP处理143B和MG63.2，于第1、3、5和7天通过台盼蓝染色后检测活细胞数目。我们发现AdR-siS100A4能够抑制143B和MG63.2细胞的增殖，其倍增时间分别为46.3±2.5、37.4±2.0，较对照组Ad-RFP分别增加了39.7%（p<0.03）、13%(p<0.05)。细胞倍增时间试验结果表明沉默S100A4的表达可抑制OS的增殖。3.沉默S100A4基因的表达可促进OS细胞凋亡用Ad-S100A4、AdR-siS100A4、Ad-RFP感染143B细胞之后，FACS实验结果显示，AdR-siS100A4组晚期凋亡细胞百分比为91.5%，约为Ad-S100A4组的1.87倍（p<0.001)。此外，用免疫细胞化学的方法对AdR-siS100A4感染的OS细胞进行caspase-3染色，发现143B和MG63.2细胞中caspase-3的表达均呈强阳性。对143B细胞而言，每个高倍视野下的caspase-3阳性细胞数AdR-siS100A4组为34±11，较Ad-RFP组增高约5.8倍（p<0.001)；对MG63.2细胞而言，caspase-3阳性细胞数AdR-siS100A4组为56±17，较Ad-RFP组增高约8.3倍（p<0.001)。结果提示沉默S100A4的表达，可以促进OS凋亡。4.沉默S100A4基因的表达可抑制OS细胞的侵袭和迁移用Ad-S100A4、AdR-siS100A4、Ad-RFP分别感染143B和MG63.2后，通过划痕愈合及transwell侵袭试验检测其侵袭和迁移能力的变化。划痕愈合试验结果显示：AdR-siS100A4感染143B细胞36h后，划痕愈合率为46%±4%，较对照组Ad-RFP下降37%（p<0.001)；AdR-siS100A4感染MG63.2细胞36h后，AdR-siS100A4组划痕愈合率为63%±3%，较对照组Ad-RFP下降24%（p<0.05)。说明沉默S100A4的表达可降低OS细胞的迁移能力。transwell侵袭试验结果表明Ad-S100A4作用于143B细胞24h后，穿过膜的细胞数为126±11，是Ad-RFP组的1.3倍（P＜0.05)，AdR-siS100A4作用于143B细胞24h后，穿过膜的细胞数为37±5，较Ad-RFP组减少61%（P＜0.001)。以上结果表明S100A4在调节143B细胞迁移和侵袭过程中起着重要的作用。5.沉默S100A4的表达可促进OS、MSC成骨分化当用Ad-S100A4、AdR-siS100A4和Ad-RFP感染MG63.2和C3H10T1/2细胞之后检测ALP的活性。结果显示，在MG63.2细胞中，AdR-siS100A4组ALP的活性较对照组明显增高。第三天、第五天AdR-siS100A4组ALP的测定值分别为15210±1814和15330±1927，与对照组Ad-RFP相比较，均增高约2.7倍（p<0.001)。对于C3H10T1/2细胞而言，AdR-siS100A4组ALP第七天的测定值为12984±1907，与对照组Ad-RFP相比较增高约2.3倍（p<0.001)。上述结果表明下调S100A4的表达可以诱导OS和MSC成骨分化。结论沉默S100A4的表达能够抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及促进OS细胞成骨分化，因此S100A4有望成为肿瘤治疗的靶点。
【作者】陈娴；
【导师】周兰；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】骨肉瘤；成骨分化障碍；RB；基因；Kras基因；P53基因；S100A4；增殖；凋亡；成骨分化；

【参考文献】
[1]章芹敏.SCM及其对我国高科技企业管理绩效评价发展的启示[D].中国地质大学,2003.
[2]张晶晶.交警行政执法体制的规范与创新[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[3]韩爽.功能化纳米材料的构建及其在肝癌早期检测中的应用[D].宁波大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[4]柯子刊.中国传统翻译理论观照下的林少华文学翻译研究[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2014,博士.
[5]曹璐.河北省高新技术企业R&D活动的现状及问题分析[J].中国商贸,2014,18:110-111.
[6]王永军.基于预案的经济动员决策系统框架研究[J].北京理工大学学报(社会科学版),2005,02:21-23.
[7]张宇.论太行精神与大学生思想政治教育[D].山西财经大学,思想政治教育,2014,硕士.
[8]伏凌波.园林地形高差的处理研究[D].中南林业科技大学,园林设计（专业学位）,2014,硕士.
[9]杨海艳.解放战争时期河南城市接管研究[D].郑州大学,中共党史,2013,硕士.
[10]赵建勋.基于宝汉高速公路环境保护及资源循环利用的关键技术研究[D].长安大学,2014.
[11]徐向南.YAP蛋白在肝细胞癌表达的临床意义及其与肝星状细胞的关系[D].复旦大学,临床医学,2013,博士.
[12]郑晋仙.论设计中的营销思维[J].艺术科技,2013,12:300.
[13]周获.基于MEMS技术的无线空中鼠标的研究[D].华侨大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[14]罗世昌.CTS2型道岔转辙机安装与维护[J].铁道通信信号.2007(04)
[15]王建忠.鹦鹉热衣原体Taqman实时荧光PCR检测方法的建立[D].南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士.
[16]黄杏元.我国地理信息系统建设及进展(3)[J].现代测绘,2004,04:3-7.
[17]邓大勇.基于粗糙集的数据约简及粗糙集扩展模型的研究[D].北京交通大学,2007.
[18]李雪冰.试论《太平经》中的“人”[D].西北大学,中国史,2013,硕士.
[19]姜小平.美国大学生学术诚信教育及启示[D].河北师范大学,教育经济与管理,2012,硕士.
[20]白永志.我国商业银行中间业务发展及影响因素分析[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[21]刘朝阳.可溶液加工的石墨烯在有机太阳能电池中的应用[D].吉林大学,2012.
[22]韩志峰.新型100W LED路灯驱动电路的设计[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2011,硕士.
[23]毛建东.粉末状物料动态称重技术的研究[D].西安理工大学,测试计量技术与仪器,2004,硕士.
[24]仝连海1,孔辉1,林浩1,周亚辉1,岳强1,李杰1,蔡征宇2.微量钛镁复合处理对低碳钢中夹杂物和组织的影响[J].钢铁钒钛,2014,06:.
[25]韩宜真.不同版本高中语文教材文言文选编的比较研究[D].东北师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[26]孙秋昌.技术引进中几个基本问题的探讨[J].机械工程.1985(03)
[27]朱雪玲.基于CORBA构件模型的可视化打包部署工具的研究与实现[D].国防科学技术大学,2004.
[28]顾爱军,李中春,钱海花.核壳结构MnCO_3@Mn_3O_4球形颗粒的制备及其电化学性能研究[J].材料导报,2013,08:52-55.
[29]孙路.基于运动学的蛋白质LOOP结构预测[D].苏州大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[30]黄攀,高新华,谢善益,鲁栗.变压器中性线直流电流监测系统的设计和应用[J].电力系统自动化,2007,01:96-99.
[31]李琳,陈德钊,束志恒,叶子青.基于预处理的决策树在化学数据挖掘中的应用[J].分析化学,2005,08:1091-1094.
[32]王勇.基于MIS和GIS的船岸信息系统研究[D].上海海事大学,2006.
[33]万志宏.情境模拟公文筐测试应用模式的探究[D].苏州大学,应用心理学,2003,硕士.
[34]周湘鄂.加强大学生隐性思想政治教育研究[D].西南大学,思想政治教育,2013,硕士.
[35]李刚,张利,文东辉.动压浮离抛光盘结构化流道的液流特性[J].上海交通大学学报,2014,11:1606-1612.
[36]刘相如.3G智能天线DOA估计方法研究[D].兰州理工大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[37]向张弩.我国慈善组织信息公开制度的建设研究[D].黑龙江大学,情报学,2013,硕士.
[38]张航.LC+LCBDE与EST+LC在肝外胆管结石中的应用[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[39]邹海林.基于喷射技术的汽车动力转向器排油装置的研究[D].长春工业大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[40]罗波.高职大学生不良情绪现状调查及其与成就动机、自我效能关系研究[D].湖南师范大学,基础心理学,2013,硕士.
[41]桑莉.知识型企业的关系营销研究[D].天津财经学院,企业管理,2004,硕士.
[42]余波.哈贝马斯晚期资本主义合法化危机思想述评[D].苏州大学,马克思主义哲学,2003,硕士.
[43]张博.《康南海六十行乐图》研究[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[44]陈雨晴.八门湾红树林小单孢菌科放线菌多样性[D].海南大学,微生物学,2014,硕士.
[45]周杜辉,李同昇,哈斯巴根,杨卫丽.陕西省县域综合发展水平空间分异及机理[J].地理科学进展,2011,02:205-214.
[46]黄雯.数据挖掘算法及其应用研究[D].南京邮电大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[47]和少寅.对逆合成孔径雷达的干扰和实现技术研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2011,硕士.
[48]张佳健.包头市产业升级对生态城市建设的影响研究[D].内蒙古科技大学,区域经济学,2014,硕士.
[49]管济.湖南省农村中小学体育教师继续教育研究[D].湖南师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[50]高建宏.不同香型烟叶中关键致香物质的GC-MS/O分析与鉴别[D].复旦大学,环境工程,2012,硕士.