Exenatide对缺氧复氧心肌细胞线粒体功能的保护作用及其机制的实验研究

【摘要】第一部分：Exenatide对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞的保护作用目的：探讨胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)类似物艾塞那肽(Exenatide)对缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)条件下H9c2心肌细胞的保护作用。方法：建立H9c2心肌细胞H/R模型。激光共聚焦及Westernblot检测正常H9c2细胞GLP-1受体(GLP-1receptor,GLP-1R)表达；给予相应浓度Exenatide预处理后，CCK-8法检测细胞存活率；分光光度计检测培养液上清乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)水平及细胞Capase-3活性，ELISA检测培养液上清肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB,CK-MB)水平；流式细胞术检测细胞凋亡；Westernblot检测细胞Cleaved-caspase-3及细胞质Cytochrome-c水平。结果：①正常H9c2心肌细胞有GLP-1R表达。②与Control组相比，H/R组H9c2细胞存活率显著降低(P<0.05)；细胞培养液LDH和CK-MB水平显著升高(P<0.05)；细胞凋亡率(26.35±0.88vs7.32±0.43)显著增加(P<0.05)；细胞Cleaved-caspase-3(0.86±0.02vs0.24±0.03)及细胞质Cytochrome-c(0.73±0.06vs0.28±0.01)水平显著升高(P<0.05)；细胞Capase-3活性(4.69±0.42vs1.00±0.00)显著增强(P<0.05)。③与H/R组相比，Exenatide+H/R组H9c2细胞存活率显著增加(P<0.05)；细胞培养液LDH和CK-MB水平显著降低(P<0.05)；细胞凋亡率(16.43±0.68vs26.35±0.88)显著减少(P<0.05)；细胞Cleaved-caspase-3(0.41±0.02vs0.86±0.02,P<0.05)及细胞质Cytochrome-c(0.35±0.01vs0.73±0.06)水平显著减少(P<0.05)；细胞Capase-3活性(2.86±0.61vs4.69±0.42)显著降低(P<0.05)。结论：Exenatide可减轻H/R条件下H9c2心肌细胞损伤；其抗凋亡作用可能与抑制线粒体凋亡通路有关。第二部分：Exenatide对H/R条件下H9c2心肌细胞线粒体的保护作用目的：探讨Exenatide对H/R条件下H9c2心肌细胞线粒体的保护作用。方法：建立H9c2心肌细胞H/R模型。Exenatide(200nM)预处理后，透射电镜观察线粒体形态结构变化；激光共聚焦及流式细胞术检测线粒体活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)、活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)、线粒体钙离子(Ca2+m)、线粒体膜电位(ΔΨm)及线粒体通透性转换孔(mPTP)开关状态；分光光度计检测细胞总超氧化物歧化酶（totalsuperoxideDismutase，T-SOD），丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)和线粒体ATPase活性；酶标仪测细胞ATP水平。结果：①与Control组相比，H/R组线粒体及线粒体嵴水肿增加，密度降低，呈空泡化；线粒体ROS(158.92±10.78vs98.57±6.03)和RNS(128.50±6.35vs100.13±11.63)生成显著增加(P<0.05)；Ca2+m水平(148.48±5.93vs85.85±4.91)显著升高(P<0.05)；ΔΨm(0.60±0.09vs1.97±0.03)显著降低(P<0.05)；mPTP开放(573.87±50.78vs864.64±46.65)显著增加(P<0.05)；细胞ATP水平(3.49±0.54vs12.25±3.12)显著降低(P<0.05)；T-SOD和ATPase活性显著降低(P<0.05)；MDA活性显著增加(P<0.05)。②与H/R组相比，Exenatide+H/R组线粒体及线粒体嵴水肿减轻，密度增加，空泡化程度减轻；线粒体ROS(126.43±12.89vs158.92±10.78)和RNS(113.85±4.97vs128.50±6.35)生成显著减少(P<0.05)；Ca2+m水平(117.91±2.82vs148.48±5.93)显著降低(P<0.05)；ΔΨm(1.10±0.06vs0.6±0.09)显著升高(P<0.05)；mPTP开放(676.92±48.27vs573.87±50.78)显著减少(P<0.05)；细胞ATP水平(7.04±0.98vs3.49±0.54)显著升高(P<0.05)；T-SOD和ATPase活性显著升高(P<0.05)；MDA活性显著降低(P<0.05)。结论：Exenatide可改善H/R条件下H9c2心肌细胞的线粒体功能。第三部分：Exenatide对H/R条件下H9c2心肌细胞线粒体保护作用的机制目的：探讨Exenatide改善H/R条件下H9c2心肌细胞线粒体功能的机制。方法：建立H9c2心肌细胞H/R模型。给予GLP-1R/cAMP/PKA信号转导通路相应抑制剂及激动剂预处理后，激光共聚焦及流式细胞术检测ROS、RNS、Ca2+m、ΔΨm及mPTP开关状态；分光光度计检测线粒体ATPase活性；酶标仪检测细胞ATP水平；Westernblot检测细胞蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)、解耦联蛋白-3(Uncouplingprotein-3,UCP-3)及核呼吸因子-1(Nuclearrespiratoryfactor-1,NRF-1)。结果：①与Exenatide+H/R组相比，Exendin-(9-39)组、Rp-cAMPS组和H-89组线粒体ROS和RNS生成显著增加(P<0.05)；Ca2+m水平显著升高(P<0.05)；ΔΨm显著降低(P<0.05)；mPTP开放显著增加(P<0.05)；细胞ATP水平显著降低(P<0.05)；ATPase活性显著降低(P<0.05)。②与Exenatide+H/R组相比，Forskolin组上述指标与Exenatide+H/R组相似，差异无统计学意义(P＞0.05)。③与Control组相比，H/R组H9c2心肌细胞PKA、UCP-3和NRF-1表达水平显著降低(P<0.05)；与H/R组相比，Exenatide+H/R组心肌细胞PKA、UCP-3和NRF-1表达水平显著增加(P<0.05)；Forskolin组上述指标与Exenatide+H/R组相似，差异无统计学意义(P＞0.05)；④与Exenatide+H/R组相比，Exendin-(9-39)组、Rp-cAMPS组和H-89组H9c2心肌细胞PKA、UCP-3和NRF-1表达水平显著降低(P<0.05)。结论：Exenatide改善H/R条件下H9c2心肌细胞线粒体功能的作用可能与激活GLP-1R/cAMP/PKA信号通路有关。
【作者】常广磊；
【导师】覃数；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】艾塞那肽；缺氧复氧损伤；细胞凋亡；线粒体；氧化应激；cAMP/PKA信号通路；

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