复元胶囊通过DDR2对软骨细胞肥厚分化影响的研究

【摘要】目的：本课题主要研究复元胶囊通过抑制Ⅱ型胶原-盘状结构域受体2（typeⅡcollagen-discoidindomainreceptor2,COLⅡ-DDR2）在骨关节炎（osteoarthritis，OA）关节软骨中的表达而影响软骨细胞肥厚分化的机制。通过培养大鼠肋软骨原代细胞，构建重组质粒载体并转染软骨细胞，检测不同DDR2表达情况下软骨细胞肥厚标志物基质金属蛋白酶13（matrixmetalloproteinases13，MMP13）、Ⅹ型胶原（typeⅩcollagen,COLⅩ）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）的mRNA及蛋白表达情况；研究在p38、MEK信号转导通路抑制剂的作用下，软骨细胞内肥厚相关蛋白的表达情况、复元胶囊含药血清对COLⅡ-DDR2引起的肥厚软骨细胞模型表达目标蛋白的影响。以此探讨COLⅡ-DDR2对软骨细胞肥厚分化的影响、DDR2细胞内信号转导和下游分子效应、复元胶囊对软骨细胞肥厚的作用，为OA的发病机制寻找实验依据，以及为OA的药物干预提供参考。方法：1.按照mankens评分标准，选取重庆医科大学附属第一医院关节置换病人关节软骨，对OA早期标本进行HE及免疫组化染色，确定COLⅡ、DDR2在OA患者关节内是否表达；采用实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）、蛋白免疫印迹（Western-blot）检测DDR2的mRNA和蛋白在OA软骨的表达。2.大鼠肋软骨细胞培养、鉴定，用Ⅱ型胶原诱导DDR2表达上调，构建含有全长DDR2基因（FulllengtheDDR2,FD）及仅含有细胞外结构（discoidindomain,DS）基因的克隆载体,转化大肠杆菌成功后进行蓝白斑筛选，挑选菌落酶切并连接表达质粒载体，转染软骨细胞。3.转染成功后用Ⅱ型胶原诱导肥厚软骨细胞模型，并检测相应的肥厚markers，即ALP、MMP13、COLⅩ的mRNA和蛋白的表达。4.采用p38通路抑制剂SB203580和MEK通路抑制剂PD98059、Wnt信号通路抑制剂Dkk1孵育软骨细胞后，检测肥厚markers的表达。5.软骨细胞分为5组，分别用复元胶囊含药血清、壮骨关节丸含药血清、空白血清进行干预，模型组细胞用Ⅱ型胶原诱导后不加干预，阴性对照组则不进行任何干预，各组检测相应肥厚markers的表达，结果进行统计学分析并得出研究结论。结果：1.免疫组合染色显示OA早期患者关节软骨即有COLⅡ、DDR2表达，软骨细胞HE染色可见软骨细胞增生、肥厚及凋亡现象，切片上可见软骨细胞肥厚的典型改变为“静止层-增生层-肥厚层-软骨下骨层”。2.目的基因和原核克隆载体pGEM-T连接后转化DH5α感受态细胞，携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中克隆，蓝白斑筛选得到纯化的重组子并和真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，构建完成后成功转染细胞。转染后的软骨细胞经胶原诱导后获得肥厚软骨细胞模型。3.采用RT-PCR及WT检测软骨细胞肥厚标志物mRNA及蛋白表达，PCR及WT结果均显示：转染FD组﹥模型组﹥转染DS组﹥未经胶原干预组，结果有统计学意义（p﹤0.05）。4.SB203580、PD98059以及Dkk1和软骨细胞孵育后，采用Ⅱ型胶原诱导软骨细胞，提取mRNA及总蛋白进行目标基因及蛋白表达测定，结果显示MEK通路抑制剂PD98059对软骨细胞肥厚markers表达无明显作用，p38通路抑制剂SB203580和Wnt信号通路抑制剂Dkk1均对软骨细胞肥厚markers表达有不同程度影响，其中Dkk1对细胞表达肥厚markers有显著影响，经过数据处理，结果显示差别具有统计学意义（p﹤0.05）。5.复元胶囊及壮骨关节丸给药后获取大鼠含药血清，软骨细胞经Ⅱ型胶原诱导后与之共同孵育，检测细胞肥厚相关基因和蛋白的表达。结果显示复元胶囊大中剂量组均对目标蛋白表达有明显的抑制作用，且大中剂量组之间无显著性差异，复元胶囊小剂量组对目标蛋白表达无明显抑制作用。差别具有统计学意义（p﹤0.05）。结论：DDR2在OA早期表达，COLⅡ-DDR2能够促进软骨细胞早期肥厚分化，使用Wnt信号通路抑制剂能显著减弱这种作用，说明COLⅡ-DDR2细胞内信号传递可能和Wnt通路有关；复元胶囊能够抑制软骨细胞肥厚分化，其作用机理可能和抑制DDR2活化有关。
【作者】张斯汉；
【导师】李荣亨；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】骨关节炎；复元胶囊；软骨细胞；DDR2；转染；

【参考文献】
[1]闫满刚.氧化铝（Al_2O_3）包覆氢化钛（TiH_2）发泡剂制备泡沫铝技术的研究[D].西安理工大学,材料工程,2003,硕士.
[2]王强.我国铜期货市场波动性及风险测量研究[D].安徽大学,金融学,2014,硕士.
[3]周伟基.35MN锻材夹杂物控制技术研究[D].东北大学,冶金工程,2010,硕士.
[4]刘炳伟.电除尘器智能管理软件的开发[D].华北电力大学（河北）,环境工程,2004,硕士.
[5]周文芳.重庆市普通高校“三自主”体育教学模式实施现状及对策研究[D].西南大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[6]李宝丽.少数民族地区思想政治教育资源开发利用研究[D].新疆大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[7]芦文波.校友资源开发视角下高校校友会组织研究[D].内蒙古农业大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[8]吴铮.基于特征的图像配准算法研究[D].浙江大学,2006.
[9]厉青,王桥,申文明,吴传庆.环境信息数据仓库建设及其相关的技术应用[J].环境监测管理与技术,2004,02:36-38.
[10]岑岭.《湖北旅游》汉英翻译实践报告[D].华中师范大学,翻译,2014,硕士.
[11]李菲.试论语文教学中的民俗教育[D].湖南师范大学,教育,2004,硕士.
[12]许雁鸿.从成长小说角度研究《百种神秘感官》[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[13]郭万里.氧化铝生料浆制备过程优化控制方法研究[D].辽宁工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[14]李璟.IPv6无线传感网协议测试关键技术研究[D].南京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[15]黄进.瑕疵出资股东权利限制研究[D].湖南大学,法本法硕,2013,硕士.
[16]杨江,李建宇.过程计算机网络系统在二次精炼和连铸中的应用[J].冶金自动化,1995,04:3-8.
[17]王琼.知识作为健康身体的隐喻[D].陕西师范大学,美学,2004,硕士.
[18]张树根.农村土地流转现状和问题研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[19]罗天祥,石培礼,罗辑,欧阳华.青藏高原植被样带地上部分生物量的分布格局(英文)[J].植物生态学报,2002,06:668-676.
[20]缪阳洋.载纳米水合氧化铁吸附剂去除水中Sb（V）的比较研究[D].南京大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[21]裴怀全.水产品脂肪酸气相色谱测定方法的比较优化及应用[D].吉林农业大学,动物营养与饲料科学,2012,硕士.
[22]陈锐锋,方路平,潘清,曹平,高坤.多模态医学图像融合超声检查系统的设计与实现[J].计算机工程,2015,04:294-299.
[23]徐冰.面向海量异构历史数据查询的索引管理系统[D].哈尔滨工业大学,软件工程,2013,硕士.
[24]王艳.信息技术与古诗词教学整合的模式及案例研究[D].东北师范大学,现代教育技术,2012,硕士.
[25]强建龙.自适应数字预失真技术的研究[D].华侨大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[26]宋福强,孔祥仕,李季泽,常伟.基于抑制消减杂交技术筛选AM真菌与紫穗槐共生相关基因[J].林业科学,2014,11:64-74.
[27]韦美丹.小胶质细胞α7-nAChR激活在Aβ介导神经干细胞失能中的作用及分子机制研究[D].南方医科大学,药理学,2012,硕士.
[28]蒙振宇.商业银行信贷风险管理研究[D].天津大学,企业管理,2004,硕士.
[29]任会之,唐立新.考虑库区吊机能力的板坯倒垛问题的建模与优化方法研究[J].自动化学报,2010,04:586-592.
[30]盛四清,范林涛,李兴,檀晓林.基于帕累托最优的配电网多目标规划[J].电力系统自动化,2014,15:51-57.
[31]陈运峰.起停系统在城市道路运行工况下的使用适应性研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[32]尹令丝.负载RPL8蛋白的DC疫苗抑制乳腺癌生长的实验研究[D].遵义医学院,免疫学,2013,硕士.
[33]安妮.保险行业客户管理系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[34]王宪淼.某船舶推进系统工作特性研究及轴承润滑分析[D].江苏科技大学,轮机工程,2014,硕士.
[35]王志峰.脊柱导引术结合手法治疗腰椎间盘突出症的临床观察[D].福建中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[36]郭九吉.氧化石墨烯及其碳纳米管修饰电极在电分析化学中的应用[D].郑州大学,2012.
[37]马维娜.当休谟遭遇卢梭[D].新疆大学,法学理论,2013,硕士.
[38]李岩.论走向交往实践的中学政治课主体性教学[D].淮北师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[39]杨晓峰,王晓鹏,范文宝,郑琼林.模块组合多电平变换器的环流模型[J].电工技术学报,2011,05:21-27.
[40]王红.宝钢水质数据库的建立及应用[J].工业水处理,2003,12:57-59.
[41]杨小华.昆山农村商业银行客户关系管理研究[D].南京农业大学,农业推广,2012,硕士.
[42]唐宏峰.“点石斋”的遗产——以初刊本、原始画稿与视觉性研究为中心[J].文学与文化,2014,04:17-32.
[43]任艳霞.电力电缆故障诊断与监测[D].北京交通大学,2008.
[44]唐红芳.汽轮机寿命在线监测与管理技术研究[D].华北电力大学（北京）,热能工程,2004,硕士.
[45]谢笑春.自我觉察对大学生社交网站自我表露的影响[D].华中师范大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[46]张宇.所有人抵押权研究[D].吉林大学,民商法学,2004,硕士.
[47]谢莹.缬沙坦防治2型糖尿病早期肾病疗效观察[D].苏州大学,内科学,2002,硕士.
[48]杨阳.基于点的全局光照效果的研究[D].杭州电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.
[49]丁庆如.氢氟酸烷基化F级管线氩弧焊丝的选择及焊接接头试验[J].石油化工设备.1991(06)
[50]刘戎.公安机关应对涉警网络舆情问题研究[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.