miRNA-21对大鼠糖尿病肾病TGF-β/Smad信号通路的调控机制研究

【摘要】目的探讨miRNA-21对大鼠糖尿病肾病TGF-β/Smad信号通路的调控作用及机制。方法一．体外细胞实验1.通过实时荧光定量PCR检测高糖和低糖条件下培养的肾小管上皮细胞miRNA-21表达的差异。2.用生物信息学方法，预测、筛选miRNA-21作用的靶基因，并分别构建野生型和突变型Smad7表达质粒，体外转染293T细胞，用双荧光素酶报告基因验证其靶基因。3.构建miRNA-21过表达慢病毒，分别转染高低糖培养的肾小管上皮细胞，用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白情况；用流式细胞仪检测其转染率；用实时荧光定量PCR检测转染后miRNA-21的表达量；用MTT法检测肾小管上皮细胞增殖情况；用Westernblot检测TGF-β/Smad信号通路Smad7的表达情况。二．动物实验1.用三联法（先切除大鼠左肾后，用高糖、高脂饮食诱导2月，再小剂量腹腔注射STZ）构建SD大鼠糖尿病肾病模型。2.SD大鼠分为DN组、miRNA-21过表达慢病毒组、空载病毒组、正常饮食组。连续3次空腹血糖≥7.0mmol/L，24h尿蛋白＞140mg/L视为建模成功。3.通过尾静脉注射miRNA-21过表达慢病毒及空病毒。4.1月后处死大鼠，取血查尿素氮。5.用实时荧光定量PCR检测miRNA-21在肾组织中的表达。6.用HE染色、PAS染色观察肾脏形态学改变；用透射电镜观察肾脏超微结构变化。7.用免疫组织化学法检测Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达。8.用Westernblot检测肾组织中Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达并行比较。结果一．体外细胞实验1.与低糖对照组相比，miRNA-21在高糖培养的肾小管上皮细胞中表达降低（p＜0.05）。2.根据生物信息学分析，Smad7可能是miRNA-21作用的靶基因，此预测在双荧光素酶报告基因中得到证实。3.流式细胞仪检测结果显示：miRNA-21过表达慢病毒体外转染肾小管上皮细胞的转染率均在60%以上。4.实时荧光定量PCR结果显示：高糖培养的肾小管上皮细胞转染过表达慢病毒后，miRNA-21的表达显著上调（p＜0.05）。5.MTT法结果显示：在转染miRNA-21过表达慢病毒的肾小管上皮细胞中，高、低糖细胞转染组的细胞增殖能力低于高糖细胞组及空病毒对照组（p＜0.05）。6.Westernblot结果显示：转染miRNA-21过表达慢病毒后Smad7蛋白的表达低于高糖空病毒组、低糖组和高糖组（p＜0.05）。二．动物实验结果(一)、糖尿病肾病模型成功1.空腹血糖：正常组空腹血糖平均值为4.637mmol/L，均＜7mmol/L。3组实验组空腹血糖平均值为13.04mmol/L，均≥7.0mmol/L。2.肾功能情况2.124小时尿蛋白正常组24小时尿蛋白平均值为118mg/L，均＜140mg/L。3组实验组24小时尿蛋白平均值为313mg/L，均＞140mg/L。2.2尿素氮正常组：尿毒氮平均值为6.2mmol/L,均＜8.2mmol/L。3组实验组：尿毒氮平均值12.1mmol/L,均＞8.2mmol/L。（二）、qPCR结果显示：注入过表达慢病毒后肾脏组织的miRNA-21的表达比空病毒组和DN组升高，差异有显著性(P＜0.05)。（三）、形态学改变1.HE染色结果正常组：肾脏组织结构正常，未见系膜细胞、系膜基质增生，基底膜无增厚，肾小球大小正常，肾小管未见病变。DN组：肾小球肿胀、系膜基质增生，伴少量系膜细胞增生，肾小管上皮肿胀。miRNA-21慢病毒组：肾小球系膜细胞增生不明显，少量系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡变性。空病毒组肾组织病变类似于DN组。2.PAS染色结果正常组：未见系膜细胞、系膜基质增生，基底膜无增厚，肾小球大小正常，肾小管未见病变。DN组：肾小球肿胀、伴少量系膜细胞增生，肾小管上皮细胞肿胀，系膜基质增生。miRNA-21慢病毒组：肾小球系膜细胞增生不明显，少量系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡变性空病毒组肾组织病变与DN组相似。3.投射电镜结果正常组：肾脏组织结构正常，肾小球形态完好，基底膜、足突结构清晰，肾小管上皮细胞正常。DN组：足突融合，基底膜增厚，溶酶体数量增多。miRNA-21慢病毒组：系膜细胞泡沫化，增生，局部基底膜增厚，溶酶体数量增多，足突融合，肾小管正常，无免疫复合物沉积。空病毒组：可见足突融合，基底膜增厚，近端小管溶酶体增多，远端小管：微绒毛少。（四）、免疫组织化学法结果：Smad7在正常组的胞浆呈弱阳性反应；在DN组及空病毒组，呈强阳性反应，胞浆可见到深棕褐色着色；在miRNA-21慢病毒组呈弱阳性反应，胞浆棕黄色着色明显减少(P＜0.05)。Smad2、Smad3在正常组的胞浆均呈阴性反应；在DN组及空病毒组，呈弱阳性反应，胞浆可见到棕黄色着色；在miRNA-21慢病毒组呈阴性反应，胞浆未见棕黄色着色(P＜0.05)。（五）、Westernblot结果显示：肾组织的Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达均较空病毒组、DN组明显降低（(P＜0.05)。结论1.miRNA-21在体外可以抑制肾小管上皮细胞的增殖，抑制Smad7蛋白的表达。2.miRNA-21在体内可以缓解大鼠的DN进展，可能是通过抑制Smad7、Smad2、Smad3蛋白的表达来实现的。干预这一过程可能是一个预防和治疗DN的新途径。
【作者】林莉；
【导师】甘华；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】miRNA-21；转染；TGF-β/Smad；糖尿病肾病；

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