新的抗分化基因HA117的鉴定、功能研究及临床意义

【摘要】第一部分HA117基因的鉴定及生物信息学分析第一节HA117基因的实验鉴定目的:以全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)建立多药耐药的白血病耐药细胞株，鉴定HA117基因的确实存在性，并获取HA117基因的序列全长。方法：(1)采用ATRA以小剂量、反复多次、浓度递增的给药方式，诱导白血病HL-60、U937、Jurkat细胞野生株，建立耐药细胞株HL-60/ATRA、U937/ATRA、Jurkat/ATRA；(2)MTT法检测HL-60、HL-60/ATRA细胞增殖情况；(3)流式细胞技术检测HL-60、HL-60/ATRA的细胞周期变化情况；(4)快速瑞氏-姬姆萨染色检测HL-60、HL-60/ATRA细胞的形态学变化；(5)采用MTT法测定HL-60、HL-60/ATRA细胞对VCR、Ara-C、DNR的耐药性；(6)实时荧光定量RT-PCR检测人端粒酶亚单位hTERTmRNA表达；(7)Westernblot检测HL-60、HL-60/ATRA细胞蛋白表达;(8)实时荧光定量PCR及常规RT-PCR检测HA117RNA在HL-60、HL-60/ATRA细胞的表达；(9)采用皮下移植的方式检测HL-60/ATRA细胞株裸鼠皮下成瘤能力；(10)采用常规RT-PCR验证已知HA117序列的表达；(11)采用目的序列的3′端RACE反应进行cDNA末端克隆。结果：(1)成功建立了耐药细胞株HL-60/ATRA；(2)与野生株HL-60细胞比较，HL-60/ATRA细胞的增殖未受到ATRA的抑制；(3)HL-60/ATRA细胞的细胞周期未受到显著影响；(4)与野生株HL-60细胞比较，HL-60/ATRA细胞形态无显著差异；(5)HL-60/ATRA细胞对Ara-C、DNR、VCR三种药物产生了不同程度耐药性；(6)HL-60/ATRA细胞的hTERTmRNA表达显著高于HL-60细胞(P<0.05)；(7)与野生株HL-60比较，CD11b、MDR1、Ube1L蛋白在HL-60/ATRA细胞株中表达降低，而CD133、c-myc、Bcl-2蛋白在HL-60/ATRA细胞株中表达升高；(8)ATRA长期小剂量浓度递增的处理后，急性髓系白血病细胞株、急性淋巴细胞白血病细胞株的HA117表达均升高；(9)长期的ATRA作用没有使HL-60/ATRA耐药细胞株的致瘤性消失；(10)HA117是可测定的PCR产物；(11)目的序列的3′端RACE反应未获得HA117的3′端全部序列。结论：HA117是一个可由ATRA诱导的在白血病耐药细胞株高表达的转录产物，与白血病细胞株的多药耐药相关，可能是一个参与抗分化过程而发挥耐药功能的基因；HA117是一个可测定序列，目前可测定的长度为254bp，因为其在细胞株中的表达丰度相对较低，还可能存在二级结构，导致全长难以获取及测序。第二节HA117基因的生物信息学分析目的:通过对HA117已知序列的生物信息学分析，以获取HA117基因的基本信息。方法：(1)利用ORFFinder进行核酸序列的开放阅读框分析；(2)利用NCBI的Blastn在线工具进行核苷酸序列比对及同源性分析；(3)利用NCBI的MapViewer及EMBL进行核酸序列的定位分析；(4)利用GENSCAN、Augustus、CPC进行HA117所在染色体序列区域的蛋白编码能力分析；(5)利用UCSC、ViennaRNAwebserver进行结构分析。结果：(1)HA117没有完整的开放阅读框，是可转录产物序列片段；(2)HA117与14号染色体上的序列相似性达100%，序列位于反向链上；(3)HA117位于14号染色体长臂上的14q24.2区域，定位于RGS6与DPF3之间；(4)HA117在理论上无蛋白编码能力；(5)HA117的核酸序列存在二级结构。结论：HA117定位于14号染色体长臂14q24.2区域，是一个长链非编码RNA的转录产物，其位于RGS6与DPF3基因之间，具有复杂的二级结构。第二部分HA117的耐药功能及机制研究第一节HA117在白血病细胞株的耐药功能与机制研究目的:探讨HA117在白血病细胞株的耐药功能及对其两侧翼蛋白编码基因的影响。方法：(1)采用ATRA0.5μM处理HL-60细胞72h，利用Real-TimePCR方法检测HA117及DPF3、RGS6的mRNA变化；(2)利用Real-TimePCR方法检测不同代次HL-60/ATRA耐药株中DPF3、RGS6mRNA的变化；(3)采用HA117-RNAi慢病毒载体及空载体病毒感染HL-60/ATRA耐药细胞株；(4)Real-TimePCR方法检测干扰HA117后DPF3mRNA的表达变化；(5)WesternBlot方法检测HL-60/ATRA耐药细胞株中DPF3蛋白的表达变化，以及HA117干扰后DPF3蛋白的表达变化；(6)MTT法测定白血病细胞对Ara-C、ADM、DNR、VCR、CTX的耐药性。结果：(1)在0.5μMATRA处理HL-60细胞72h后，DPF3bmRNA显著降低（P<0.05），而HA117RNA的表达量显著升高（P<0.05）；(2)在ATRA处理后的第10代、20代、30代、40代、50代HL-60/ATRA细胞中，DPF3mRNA的表达均较未给予ATRA处理的HL-60细胞显著降低（P<0.05）；(3)HA117-RNAi慢病毒载体及LV-vector空病毒成功感染HL-60/ATRA耐药细胞株；(4)HL-60/ATRA细胞的DPF3bmRNA表达量显著高于HL-60/ATRA对照组与LV-vector空病毒对照组（P<0.05）；(5)野生株HL-60与HL-60/ATRA细胞中DPF3蛋白表达无显著差异；(6)干扰HA117后HL-60/ATRA白血病细胞对Ara-C、ADM、DNR、VCR、CTX的耐药性降低。结论：HA117是一个参与白血病多药耐药的LncRNA；调控其近邻蛋白编码基因DPF3bmRNA表达可能是其耐药机制的一部分；其参与多药耐药的机制有区别于经典多药耐药基因之处。第二节HA117在临床白血病的表达研究目的:探讨HA117在临床白血病病例中表达分布的临床意义。方法：将100例儿童白血病和41例成人白血病骨髓分为初诊组、缓解组和难治/复发组，12例ITP患儿及5例IDA成人患者骨髓为对照组。应用Real-TimePCR法检测骨髓单个核细胞中HA117RNA及Bcl-2、c-myc、RARα、PU.1、DPF3b、bcrpmRNA表达。结果：(1)在儿童白血病例中HA117在初诊组、缓解组、难治/复发组、对照组中的阳性表达率分别为76.00%、71.64%、100.00%、33.33%；在成人白血病例中HA117在初诊组、缓解组、难治/复发组、对照组中的阳性表达率分别为68.42%、56.25%、85.71%、80.00%；(2)HA117的表达与患者性别、年龄、白血病分型无显著相关性；(3)在初诊AML患儿中，高危组的HA117表达量显著高于标危组与中危组(P<0.05)；在初诊ALL患儿中，高危组与中危组的HA117表达量显著高于标危组(P<0.05)；(4)在缓解ALL患儿中，高危组与中危组的HA117表达量显著高于标危组(P<0.05)；在缓解AML患儿中，中危组、高危组的HA117相对表达量，均高于标危组病例；(5)在难治/复发白血病患儿中，高危组的HA117表达量显著高于标危组（P<0.05）与中危组（P<0.05）。(6)在ALL患儿中，难治/复发组的HA117表达量显著高于初诊组与缓解组(P<0.05)；在AML患儿中，难治/复发组的HA117表达量显著高于初诊组与缓解组(P<0.05)；(7)在成人AML患者中，初诊组与难治/复发组的HA117表达量高于缓解组；在成人ALL患者中，难治/复发组的HA117表达量显著高于初诊组与缓解组(P<0.05)；(8)在成人慢性白血病患者中，难治/复发组的HA117表达量显著高于初诊组与缓解组(P<0.05)；(9)在儿童白血病Bcl-2相对表达量均值于初诊组、难治/复发组高于缓解组；(10)在儿童白血病c-myc相对表达量均值于初诊组、难治/复发组高于缓解组；(11)在儿童，PU.1的相对表达量初诊组、缓解组、难治/复发组之间无显著差异(P>0.05)；(12)在儿童病例RARα的相对表达量均值缓解组、难治/复发组高于初诊组；(13)在儿童DPF3b的相对表达量于初诊组、缓解组、难治/复发组之间无显著差异(P>0.05)；(14)在儿童bcrp的相对表达量于初诊组、难治/复发组之间无显著差异(P>0.05),二者均值高于缓解组。结论：HA117既参与了白血病的原发耐药，也参与了化疗药物诱导的获得性耐药，但主要是获得性耐药。HA117的高表达与白血病严重程度和危险度分层相关，HA117可能是一个白血病严重程度判断和危险度分层的指标。第三部分HA117在先天性肠无神经节细胞症的表达研究目的:探讨ATRA相关的LncRNAHA117及其相邻的DPF3基因在先天性无神经节细胞症(HD)中的表达分布。方法:将25例HD的结肠组织分为痉挛段、扩张段和吻合口，7例非HD患儿肠道标本作为参照。(1)应用Real-TimePCR法检测HD各段肠道组织的HA117RNA及RARα、DPF3bmRNA表达；(2)原位杂交检测HA117在HD各节段表达；(3)WesternBlot检测人RARα、Bcl-2蛋白在HD各节段表达；(4)免疫组织化学染色检测DPF3、钙视网膜蛋白(CR)在HD各节段表达。结果:(1)在HD的痉挛段HA117RNA表达量显著高于扩张段与吻合口（P<0.05）；扩张段与吻合口的DPF3b、RARαmRNA表达量显著高于痉挛段（P<0.05）；(2)在肠道粘膜层中，HA117在HD的痉挛段肠道组织中表达分布最多，多于扩张段与吻合口；而在肌层中，HA117在痉挛段肠道组织中表达分布也多于扩张段与吻合口；(3)RARα的相对表达量在痉挛段表达低于扩张段（P<0.05）与吻合口（P<0.05）；Bcl-2在痉挛段的表达量显著高于扩张段（P<0.05）和吻合口（P<0.05）；(4)DPF3的免疫组化着色与CR一致，于吻合口肌间神经丛表达最明显，痉挛段未见阳性染色。结论:通过先天性肠无神经节细胞症25例分析得出，HA117可能在HD的形成中发挥着抗分化作用，HA117可能是先天性肠无神经节细胞症形成的重要因素之一。
【作者】刘行；
【导师】金先庆；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】ATRA；HA117；多药耐药；白血病；生物信息学；RNA；染色体；DPF3b；耐药；机制；功能；DPF3；分化；无神经节细胞症；

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