高脂及炎症状态激活mTOR信号通路导致肝脏CD36翻译效率升高

【摘要】目的：非酒精性脂肪肝病（non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）已经成为危害人类健康的主要代谢性疾病之一，但其发病机制尚不完全清楚。高脂及炎症状态均可以作为独立的危险因素导致NAFLD的发生发展。CD36属于B族清道夫受体，可以介导长链脂肪酸及氧化低密度脂蛋白的跨膜转运，其表达量与肝脏脂肪变性程度密切相关。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它在调节细胞生长、增殖及蛋白质翻译中起着重要的作用。本课题旨在研究高脂及炎症状态是否可以通过激活mTOR信号通路导致CD36翻译效率升高，最终引起CD36蛋白表达量及肝细胞内脂质蓄积增加。方法：使用软脂酸、TNF-及IL-6处理人肝癌细胞株HepG2，高脂饲料喂养及酪蛋白皮下注射C57BL/6J小鼠的方法建立体外及体内高脂及炎症模型。HepG2细胞分为：对照组1（0.2%BSA）、软脂酸处理组（0.2%BSA+0.08mmol/L软脂酸）、对照组2（0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸）、TNF-处理组（0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+25ng/mLTNF-）、IL-6处理组（0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+20ng/mLIL-6），处理时间为24小时。雄性C57BL/6J小鼠分为：正常饲料组（正常饲料）、高脂饲料组（高脂饲料）、正常饲料+酪蛋白处理组（正常饲料+0.5mL10%酪蛋白皮下注射），建模时间为14周。油红O染色观察肝细胞内脂质蓄积的情况。酶联免疫吸附试验及酶偶联比色法分别检测肝细胞内游离脂肪酸（FFA）及甘油三酯（TG）含量。Real-TimePCR检测肝细胞CD36mRNA表达。WesternBlotting检测肝细胞CD36蛋白表达，mTOR及其下游翻译调控蛋白：核糖体蛋白p70S6激酶（p70ribosomalproteinS6kinase，p70S6K）、eIF4E结合蛋白1（eukaryoticinitiationfactor4E-bindingprotein1，4E-BP1）及真核翻译起始因子4E（eukaryoticinitiationfactor4E，eIF4E）的磷酸化水平。蛋白降解实验检测肝细胞CD36蛋白稳定性。多聚核糖体分析检测肝细胞CD36翻译效率。并应用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素作用于高脂及炎症状态下的HepG2细胞（10ng/mL雷帕霉素）及C57BL/6J小鼠（2mg/kg体重的雷帕霉素皮下注射），观察其对上述检测指标的影响。结果：油红O染色、FFA及TG定量检测发现高脂及炎症状态能使HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织脂质蓄积增加（P<0.05）。WesternBlotting及Real-TimePCR检测发现高脂及炎症状态能使CD36蛋白表达量升高（P<0.05），而CD36蛋白表达量却没有明显变化（P>0.05）。蛋白降解实验发现高脂及炎症状态并没有改变HepG2细胞CD36蛋白稳定性（P>0.05）。多聚核糖体分析发现高脂及炎症状态可以使CD36翻译效率明显升高。进一步行WesternBlotting检测发现高脂及炎症状态可以升高mTOR及其下游翻译调控蛋白p70S6K、4EBP-1及eIF4E的磷酸化水平（P<0.05）。加入雷帕霉素之后，相应的高脂及炎症处理组mTOR信号通路磷酸化水平降低（P<0.05），导致CD36翻译效率及蛋白表达量减少（P<0.05），最终引起HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织脂质蓄积减轻（P<0.05）。结论：高脂及炎症状态可以激活HepG2细胞及C57BL/6J小鼠肝脏组织mTOR信号通路导致肝脏CD36翻译效率升高，最终引起CD36蛋白表达及脂质蓄积增加。
【作者】王川；
【导师】阮雄中；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】非酒精性脂肪肝病；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；CD36；

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