海马区自噬在大鼠创伤/应激后认知功能下降中的作用及机制

【摘要】目的通过观察年龄因素对大鼠脾切除术后海马区自噬、神经炎症反应和认知功能的影响，进一步采用工具药雷帕霉素或Exendin-4，探讨激活海马区自噬、抗神经炎症反应或二者联合对老年大鼠脾切除术后认知功能的影响及机制；观察电休克（ECS）、丙泊酚联合ECS对抑郁大鼠海马区自噬的影响，以评价海马区自噬在老年大鼠术后认知功能下降、抑郁大鼠ECS后学习记忆功能减退及丙泊酚对其保护效应中的作用及机制。方法第一部分：实验1成年（5~6月龄）雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠和老年（24~25月龄）雄性SD大鼠各36只，适应实验室环境1周后，分别被随机分为3组（n=12）：对照组（ac组和AC组）、麻醉组（aa组和AA组）及手术组（ao组和AO组）。麻醉组大鼠接受腹腔注射氟哌利多500μg/kg复合芬太尼20μg/kg全身麻醉；手术组大鼠于麻醉（麻醉方式同麻醉组）满意后接受脾切除术。对照组大鼠于相同时点接受腹腔注射等容积生理盐水。采用Morris水迷宫（Morriswatermaze，MWM）于术前连续6天及术后1天检测大鼠学习记忆功能，最后1次水迷宫实验后，各组随机选取6只大鼠，以4%多聚甲醛灌注固定取脑组织，其余6只大鼠处死后采集新鲜海马组织低温冰冻保存待测。采用透射电子显微镜检测海马区自噬情况；免疫荧光双标检测自噬标记蛋白LC3Ⅱ与神经元标记蛋白NeuN共表达；免疫组织化学检测小胶质细胞标记蛋白Iba1表达；Westernblot测定自噬特异性蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62以及炎症因子IL-1β和IL-6蛋白表达。实验2老年（24~25月龄）雄性SD大鼠60只，适应性饲养1周后随机分成5组（n=12）：对照组（C组）、脾切除术组（O组）、二甲基亚砜（DMSO）+脾切除术组（OD组）、雷帕霉素+脾切除术组（OR组）和雷帕霉素+3-甲基腺嘌呤（3-MA）+脾切除术组（ORM）。O组于氟哌利多复合芬太尼神经安定麻醉下给予侧脑室（右）注射0.9%生理盐水（NS）5μl，15min后接受脾切除术；OD、OR和ORM组大鼠分别于术前15min给予侧脑室（右）注射DMSO2μl+NS3μl，雷帕霉素2μl（35pmol）+NS3μl，雷帕霉素2μl（35pmol）+3-MA2μl（600nmol）+NS1μl；C组在相同时点给予腹腔注射等容积NS。实验流程及指标检测同实验1。实验3老年（24~25月龄）雄性SD大鼠48只，适应性饲养1周后被随机分成4组（n=12）：对照组（C组）、Exendin-4组（E组）、脾切除术组（O组）、Exendin-4+脾切除术组（OE组）。OE组大鼠术前30min接受腹腔注射Exendin-410μg/kg，同前于氟哌利多复合芬太尼神经安定麻醉下接受脾切除术，术毕12h再次给予腹腔注射Exendin-410μg/kg；O组于OE给药相同时点给予腹腔注射等容积NS，余同OE组；E组同OE组给予Exendin-4但不予手术；C组于相同时点同O组给予NS但不予手术。实验流程及指标检测同实验1。第二部分：清洁级成年雄性SD大鼠（体重200~250g，2~3月龄）40只，建立孤养加慢性轻度不可预见性应激抑郁模型后随机分成4组（n=12），抑郁模型组（D组）、丙泊酚组（P组）、ECS组（E组）和丙泊酚联合ECS组（PE组）。D组予伪ECS处理（只夹电极但不通电），P组仅给与腹腔注射丙泊酚80mg/kg，E组仅给与ECS处理，PE组给与腹腔注射丙泊酚80mg/kg待翻正反射消失后再给与ECS，各组干预均为每天1次，连续7天。ECS后采用糖水偏好实验（糖水偏好百分比）和旷场实验（水平活动距离和直立次数）评价抑郁行为，Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能，最后一次测试完毕即处死大鼠，每组随机选择3只灌注固定后分离海马组织修块，采用透射电子显微镜检测自噬情况，随机选择6只采集海马组织冻存待测，采用Westernblot法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62表达情况，ELISA检测突触素表达。结果第一部分：实验1术前老年大鼠比成年大鼠学习记忆功能更差；手术损害了成年或老年大鼠空间学习记忆功能及认知灵活度，老年大鼠损害更甚；成年或老年大鼠手术创伤后海马区电镜下可见散在自噬溶酶体，免疫荧光双标可见LC3Ⅱ与NeuN共表达，二者共表达神经元周围可见LC3Ⅱ散在表达；海马区自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ基础水平，老年大鼠低于成年大鼠，手术创伤上调二者表达，p62蛋白表达变化趋势与Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ相反，年龄因素和手术因素对自噬相关蛋白的影响具有交互效应；手术创伤激活了海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达，相较成年大鼠，老年大鼠这种激活效应被放大，而三种蛋白基础水平老年大鼠高于成年大鼠。实验2老年大鼠脾切除术后海马区自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达上调，p62表达下调；海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达上调；空间学习记忆功能下降。雷帕霉素可进一步上调Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达，下调p62表达；下调海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达；减轻术后学习记忆损害。3-MA完全逆转了雷帕霉素上调Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达，下调p62表达的效应，部分削弱其下调海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达及改善术后学习记忆功能的效应。实验3老年大鼠脾切除术后，海马区自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达上调，p62表达下调；海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达上调；空间学习记忆功能下降。使用Exendin-4可降低术后12h和24h血糖水平；进一步上调老年大鼠术后海马区自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ水平，下调p62表达，抑制海马区Iba1、IL-1β和IL-6蛋白表达，减轻术后学习记忆功能损害。第二部分：ECS后糖水偏好百分比以及旷场实验水平活动距离和直立次数，与D组相比，E组和PE组增加，而D组和P组间、E组和PE组间差异无统计学意义；ECS后学习记忆，D组和P组间差异无统计学意义，与D组相比，E组和PE组均下降，与E组相比，PE组有改善。E组和PE组电镜下均可见自噬溶酶体，海马组织Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和突触素蛋白表达，与D组相比，P组无差异，E组和PE组表达上调，与E组相比，PE组表达下调，p62变化趋势与Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ相反。结论（1）老年大鼠较成年大鼠术后认知功能下降得更明显，与老年大鼠术后海马区自噬不能被有效激活以及神经炎症反应被年龄因素放大有关；（2）激活海马区自噬可减轻老年大鼠术后认知功能下降；术前给予雷帕霉素可保护老年大鼠术后认知功能，抑制海马区神经炎症反应可解释其保护效应的部分机制。（3）老年大鼠术后认知功能下降与手术创伤导致术后血糖升高和海马区神经炎症反应及其相互作用并影响自噬水平有关；Exendin-4通过稳定术后血糖，促进海马区自噬和抗神经炎症反应保护老年大鼠术后认知功能。(4)ECS后抑郁大鼠认知功能下降与其过度激活海马区神经细胞自噬并促进突触素过表达有关；丙泊酚通过抑制海马区神经细胞自噬过度激活及突触素的过度表达，发挥保护抑郁大鼠ECS后认知功能的效应。
【作者】黎平；
【导师】闵苏；
【作者基本信息】重庆医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】自噬；认知功能障碍；应激；电惊厥治疗；抑郁症；

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