复元胶囊通过MAPKs通路调节OPG-RANKL-RANK系统防治骨关节炎的实验研究

【摘要】第一部分IL-1β和1α.25(OH)2D3对OPG-RANKL-RANK系统影响机制的实验研究目的：明确OA软骨细胞中MAPKs通路与OPG-RANKL-RANK系统的关系。方法：以SW1353细胞为研究对象，分为9组。分别以IL-1β、1.25（OH）2D3、p38信号通路抑制剂SB203580，ERK1/2信号通路抑制剂PD980959和JNK信号通路抑制剂SP600125对SW1353进行干预，模型组细胞分别以IL-1β、1.25（OH）2D3诱导后不做任何处理。Westernblot法检测磷酸化p38（p-p38）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的表达。qRT-PCR法检测OPG、RANKL和RANKmRNA的表达。ELISA法检测OPG、RANKL蛋白的表达。结果：Westernblot法结果显示IL-1β诱导SW1353后，p-p38、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白水平高于正常组。各通路抑制剂均能抑制其活化。1.25(OH)2D3诱导SW1353后，p-ERK1/2水平显著高于正常组，而p-p38和p-JNK低于正常组，差异具有统计学意义（p<0.05）。SB203580组、PD98059组p-p38、p-JNK表达与模型组差异无统计学意义（p>0.05）。qRT-PCR和ELISA法结果显示IL-1β诱导SW1353后，OPG、RANKL、RANKmRNA和蛋白的表达和OPG/RANKL比值高于正常组。SB203580组OPGmRNA、蛋白水平和OPG/RANKL比值低于模型组，而RANKmRNA、RANKLmRNA和蛋白量高于模型组；PD98059组OPG/RANKL比值高于模型组，差异具有统计学意义（p<0.05），而OPGmRNA、蛋白水平高于模型组，RANKmRNA、RANKLmRNA和蛋白水平低于模型组，差异均无统计学意义（p>0.05）；SP600125组RANKL、OPGmRNA和蛋白、RANKmRNA表达明显低于模型组，OPG/RANKL比值高于模型组，差异具有统计学意义（p<0.05）。1.25(OH)2D3诱导SW1353后，OPGmRNA、蛋白的水平和OPG/RANKL比值低于正常组，RANKLmRNA和蛋白，RANKmRNA表达高于正常组。PD98059组OPGmRNA、蛋白的水平和OPG/RANKL比值高于模型组，RANKLmRNA和蛋白，RANKmRNA表达低于模型组，差异均具有统计学意义（p<0.05）。SB203580组和SP600125组OPG，RANKL，和RANK表达较模型组，差异无统计学意义（p>0.05）。结论：MAPKs通路可调节OA软骨细胞OPG、RANKL、RANK的水平。第二部分：OPG对人软骨细胞增殖和凋亡影响的实验研究目的：明确OPG对软骨细胞的作用及机制。方法：予以不同浓度的重组人OPG-Fc作用于SW1353，MTT法检测细胞生存率，并筛选OPG-Fc的最佳作用浓度和时间纳入后续试验。以SW1353为研究对象，分为7组。分别以OPG-Fc、SB203580和PD980959对SW1353进行干预。Westernblot法检测p-p38、p-ERK1/2蛋白的表达。qRT-PCR法检测Bax、Bcl-2和caspase3mRNA的表达。流式细胞术检测细胞周期。结果：MTT结果提示:25ng/ml、50ng/ml的OPG-Fc能够促进SW1353细胞增殖，且50ng/ml组优于25ng/ml组。而100ng/mlOPG促进细胞凋亡。其中以72h作用显著。Westernblot法结果显示，OPG-Fc诱导SW1353后，50ng/mlOPG-Fc组p-p38蛋白水平低于正常组，p-ERK1/2蛋白水平高于正常组，而100ng/ml组p-p38表达高于正常组，p-ERK1/2低于正常组。qRT-PCR法结果显示，50ng/mlOPG-Fc组Bax、caspase3mRNA和Bax/Bcl-2比值水平低于正常组，Bcl-2mRNA水平高于正常组，可被PD98059抑制；100ng/mlOPG-Fc组Bax、caspase3mRNA和Bax/Bcl-2比值水平高于正常组，而Bcl-2mRNA表达低于正常组，可被SB203580拮抗。流式细胞结果显示50ng/mlOPG-Fc组细胞增殖指数（PI）高于正常组，可被PD98059抑制；100ng/mlOPG-Fc组PI低于正常组，可被SB203580拮抗，差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：OPG通过MAPKs通路调节软骨细胞的增殖/凋亡，其作用因OPG浓度的改变而改变。第三部分：淫羊藿苷通过MAPKs通路对OPG-RANKL-RANK系统影响的实验研究目的：观察淫羊藿苷对OPG-RANKL-RANK系统的影响。方法：予以不同浓度的Icariin作用于SW1353，MTT法检测细胞生存率，并筛选Icariin的最佳作用浓度和时间纳入后续试验。以SW1353为研究对象，分为7组。分别以IL-1β、SB203580、PD980959和Icariin对SW1353进行干预，模型组细胞以IL-1β诱导后不做任何处理。Westernblot方法检测p-p38、p-ERK1/2蛋白的表达。qRT-PCR法检测OPG、RANKL和RANKmRNA的表达。ELISA法检测OPG、RANKL蛋白的表达。结果：MTT结果显示，3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml淫羊藿苷促进细胞增殖，呈剂量-时间依赖性，以12μg/ml48h促细胞增殖效果最好。Westernblot法结果显示，淫羊藿苷干预后，p-p38蛋白的表达低于模型组，p-ERK1/2的表达高于模型组。qRT-PCR和ELISA法结果显示Icariin组OPG、RANKLmRNA和蛋白、RANKmRNA和OPG/RANKL的表达低于模型组，SB203580能增强Icariin下调的OPG和OPG/RANKL水平，但PD98059能抑制此过程，差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：淫羊藿苷能够促进软骨细胞的增殖。调控MAPKs通路。下调OPG、RANKL、RANK和OPG/RANKL的水平。第四部分：复元胶囊通过MAPKs通路对OPG-RANKL-RANK系统影响的实验研究目的：观察复元胶囊对OPG-RANKL-RANK系统的影响，探讨其治疗OA的作用机制。方法：予以不同浓度的FYC-CS作用于SW1353，MTT法检测细胞生存率，并筛选Icariin的最佳作用浓度和时间纳入后续试验。以SW1353为研究对象，分为9组。分别以IL-1β、1.25（OH）2D3、PD980959、正常兔血清和FYC-CS对SW1353细胞进行干预，模型组细胞分别以IL-1β组、1.25（OH）2D3诱导后不做任何处理，Westernblot法检测p-ERK1/2蛋白的表达。qRT-PCR法检测OPG、RANKL和RANKmRNA的表达。ELISA法检测OPG、RANKL蛋白的表达。结果：MTT结果显示，5％-15%FYC-CS能促进细胞增殖，但20％、25%FYC-CS组细胞增殖减弱。以15%的FYC-CS，48h促细胞增殖效果最好。Westernblot法结果显示IL-1β诱导SW1353后，FYC-CS组p-ERK1/2高于模型组。1.25(OH)2D3诱导SW1353后，FYC-CS组p-ERK1/2水平低于模型组，qRT-PCR和ELISA法结果显示，IL-1β诱导SW1353后，FYC-CS组OPG、RANKLmRNA和蛋白、RANKmRNA和OPG/RANKL表达低于模型组，PD98059有拮抗FYC-CS的作用；1.25(OH)2D3诱导SW1353后，FYC-CS组OPGmRNA和蛋白、OPG/RANKL水平高于模型组，RANKLmRNA和蛋白和RANKmRNA水平低于模型组，差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：⑴复元胶囊能够明显促进软骨细胞增殖。通过ERK1/2通路调节OPG，RANKL，RANK和OPG/RANKL的表达，延缓OA的进程。⑵复元胶囊促软骨细胞增殖作用及对OPG-RANKL-RANK系统的调节作用优于淫羊藿苷。
【作者】王泽明；
【导师】李荣亨；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】复元胶囊；丝裂原活化蛋白激酶信号通路；骨保护素；核转录因子KB受体激动剂的配体；核因子KB受体活化因子；

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