壳聚糖及壳聚糖—酵母多糖复合微球抗大鼠PCP的研究

【摘要】背景和目的肺孢子菌（pneumocystis）可寄生于有免疫缺陷的人和多种哺乳动物肺组织内，引起肺孢子菌性肺炎（pneumocystispneumonia，PCP）。在人类PCP经常发生于AIDS、长期接受抗肿瘤药物和免疫抑制剂的患者。随着此类患者的增多，PCP患病率呈增多趋势，因此受到越来越多的关注。目前PCP主要依靠药物治疗，常用的药物有磺胺甲基异恶唑-甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim-Sulfamethoxazole，Tmp-Smz）、潘他米丁、氨苯砜和阿托伐醌等。但是这些药物的治疗效果欠佳，并且存在不同程度的副作用，并随之出现了对这些药物的耐受性。因此研究新的抗PCP的药物变的日益迫切。壳聚糖为一种多聚糖，通常是有甲壳素通过脱乙酰作用获得，壳聚糖制取方便并且具有好的生物学相容性、生物可降解性和无毒性。研究发现壳聚糖具有抗细菌和真菌的作用。酵母多糖为来自于酿酒酵母，可以作为Dectin-1受体的激活剂，从而起到免疫调节作用。研究发现Dectin-1受体具有抵抗肺孢子菌感染的作用，而PCP患者出现Dectin-1受体表达下调，酵母多糖具有上调Dectin-1受体从而增强患者抗肺孢子菌感染的作用。但是目前为止没有将壳聚糖和酵母多糖应用于抗PCP研究的报道。本研究拟从壳聚糖具有抗菌作用和酵母多糖具有升高Dectin-1受体的作用为切入点，同时利用壳聚糖-酵母多糖微球的缓释作用，对其抗大鼠PCP的效果进行研究，此次研究将为壳聚糖和酵母多糖治疗PCP提供理论依据。本研究目的在于在大鼠PCP模型体内探讨壳聚糖及壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP的治疗效果，并探讨相关的作用机制。方法1.大鼠PCP模型的构建和分组通过每周两次给大鼠后腿肌注地塞米松磷酸钠的方式构建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型构建成功后，随机将大鼠分为以下7组：免疫正常组、0.5%壳聚糖-免疫正常组、PCP模型组、0.1%壳聚糖组、0.5%壳聚糖组、0.2%乙酸组和Tmp-Smz组（Tmp0.0215mg/g和Smz0.11mg/g体重）。2.在大鼠PCP模型中研究0.5%壳聚糖对PCP大鼠体重增加量、肺重、肺重/体重（lungweight/bodyweight，LW/BW）比率和存活率的影响药物治疗开始前和开始后分别对大鼠进行称重，处死大鼠后称量大鼠肺重。通过对大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，评估药物的治疗效果。3.在大鼠PCP模型中研究0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织的影响取大鼠肺组织进行苏木素-伊红（HematoxylinandEosin，HE）染色，通过光镜观察各组大鼠肺组织变化和炎症浸润。4.扫描电镜（scanningelectronmicroscope，SEM）和透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察各组肺孢子菌的超微结构改变取大鼠肺组织通过SEM和TEM观察药物对肺孢子菌的超微结构破坏。5.实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量取大鼠肺组织提取总RNA，定量PCR检测肺组织内肺孢子菌的HSP70mRNA表达量。6.ELISA法检测各组大鼠血清内IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量采集大鼠腹主动脉血，提取血清。用ELISA法检测药物对血清内IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子含量的影响。7.使用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的含量采集大鼠腹主动脉血，用流式细胞术检测药物对大鼠CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的影响。8.大鼠PCP模型的构建和分组通过每周两次给大鼠后腿肌注地塞米松磷酸钠的方式构建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型构建成功后，随即将大鼠分为以下7组：免疫正常组、PCP模型组、0.5%壳聚糖组、0.5%壳聚糖+0.9%氯化钠组、0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组、0.5%壳聚糖+1%酵母多糖组、0.8%壳聚糖-酵母多糖微球组。9.在PCP大鼠体内研究0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响治疗开始前和开始后分别对大鼠进行称重，处死大鼠后称量大鼠肺重。通过对大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，评估药物的治疗效果。10.在PCP大鼠体内研究0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织的影响取大鼠肺组织进行HE染色，通过光镜观察各组大鼠肺组织改变和炎症浸润。11.TEM观察各组肺孢子菌的超微结构改变取大鼠肺组织通过TEM观察药物对肺孢子菌的超微结构破坏。12.实时荧光定量PCR检测各组大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量取大鼠肺组织提取RNA，定量PCR检测药物对大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量的影响。13.实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量切取大鼠肺组织提取总RNA，定量PCR检测肺孢子菌的HSP70mRNA表达量。14.ELISA法检测大鼠血清内细胞因子的含量采取大鼠腹主动脉血，提取血清。用ELISA法观察药物对血清内IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ、MCP-1、IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子含量的影响。结果1.0.5%壳聚糖对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响0.5%壳聚糖治疗后大鼠体重增加量明显高于PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组；0.5%壳聚糖治疗后大鼠肺重和LW/BW比率明显低于PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。0.5%壳聚糖治疗后大鼠存活率高于PCP模型组和0.2%乙酸组。2.0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织的影响0.5%的壳聚糖治疗后，PCP大鼠肺组织内炎细胞和巨噬细胞明显减少，肺泡腔内无泡沫样物质，而PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组肺组织内可见大量炎细胞浸润并可见泡沫样物质形成。3.0.5%壳聚糖对肺孢子菌超微结构的影响0.5%的壳聚糖治疗后，电镜下肺孢子菌的超微结构表现出明显的破坏，可见核固缩、胞膜表面结构不完整。4.0.5%壳聚糖对PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量的影响0.5%的壳聚糖治疗后，PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量明显低于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。5.0.5%壳聚糖对PCP大鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子含量的影响0.5%的壳聚糖治疗后PCP大鼠血清内IL-10、IFN-γ细胞因子的含量明显高于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组，而TNF-α细胞因子的含量明显低于PCP模型组，0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组。6.0.5%壳聚糖对PCP大鼠动脉血内CD4+T和CD8+T淋巴细胞的影响0.5%的壳聚糖治疗后与PCP模型组、0.2%乙酸组和0.1%壳聚糖组相比明显提高了PCP大鼠动脉血内CD4+T淋巴细胞含量，与PCP模型组和0.2%乙酸组相比降低了CD8+T淋巴细胞含量。7.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠体重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影响0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比明显提高了PCP大鼠的体重增加量，并且降低了PCP大鼠的肺重和LW/BW比率。0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后大鼠存活率高于模型组。8.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织的影响0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比PCP大鼠肺组织内炎细胞明显减少。9.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织内Dectin-1和TLR-4受体mRNA表达量的影响0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后与PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组相比明显提高了PCP大鼠肺组织内Dectin-1受体mRNA和降低了PCP大鼠肺部TLR-4受体mRNA的表达量。10.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量的影响0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后，PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量明显低于PCP模型组，0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组。11.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球对PCP大鼠血清内细胞因子的影响0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后PCP大鼠血清内IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子的含量明显高于PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组，而IL-1α、IL-6和TNF-α细胞因子的含量明显低于PCP模型组、0.5%壳聚糖组和0.5%壳聚糖+0.5%酵母多糖组。0.8%的壳聚糖-酵母多糖复合微球治疗后PCP大鼠血清内MCP-1细胞因子的含量明显高于PCP模型组，IL-2细胞因子的含量明显低于PCP模型组。结论1.0.5%的壳聚糖可以减少PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量、降低LW/BW比率、减轻肺部炎症浸润，并且能够增加血清内IFN-γ、IL-10细胞因子含量和CD4+T淋巴细胞数量，减少CD8+T淋巴细胞数量和TNF-α细胞因子含量，并且还能够引起肺孢子菌超微结构破坏。2.0.8%壳聚糖-酵母多糖复合微球可以减少PCP大鼠肺组织内肺孢子菌HSP70mRNA表达量、TLR-4受体mRNA表达量、降低LW/BW比率、减轻肺部炎症浸润，并且能够增加PCP大鼠肺组织内Dectin-1受体mRNA表达量和血清内IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ和MCP-1细胞因子含量，减少了血清内IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α细胞因子含量，并且还能够引起肺孢子菌超微结构破坏。
【作者】刘爱波；
【导师】叶彬；
【作者基本信息】重庆医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】肺孢子菌肺炎；大鼠；壳聚糖；壳聚糖-酵母多糖复合微球；

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