油菜（Brassica napus）种子萌发响应NaCl胁迫的生理学与蛋白质组学研究

【摘要】种子是植物繁殖的基础,其萌发过程是植物生活史中最重要的阶段之一,且该阶段对盐胁迫极为敏感。盐胁迫是严重影响植物生长,限制产量和区域分布的重要因素之一。盐胁迫首先通过阻碍水分的吸收影响种子的萌发。其次,盐进入种子会导致细胞水平的损伤,从而进一步抑制种子的萌发。在细胞水平上,离子进入细胞后会打破离子稳态以及产生活性氧自由基。活性氧自由基诱发的氧化胁迫能够造成生物大分子结构的损伤,从而对细胞的代谢造成有害的影响。油菜种子是植物油的重要来源。本文以油菜种子为研究材料探索种子萌发过程中的耐盐生理机制。分析了不同浓度NaCl胁迫(0、50、100和200mM)以及与相应盐胁迫等渗的甘露醇胁迫(0、100、200和400mM)下种子萌发率和根芽生长等的变化；检测了成熟种子及不同浓度NaCl胁迫和与盐胁迫等渗的甘露醇胁迫下萌发种子中含水量、膜透性、渗透保护物质、活性氧自由基、抗氧化酶和抗氧化剂等指标；比较了成熟种子和NaCl胁迫下萌发种子中Na+、K+和Ca2+的含量。同时,我们利用高通量蛋白质组学技术鉴定到种子萌发前后54种差异表达蛋白质,以及盐胁迫下萌发种子中46种差异表达蛋白质。生理学研究结果表明,在种子萌发过程中,可溶性糖含量下降、脯氨酸和甜菜碱含量上升,100mMNaCl条件下,可溶性糖含量、脯氨酸和甜菜碱含量均上升,但在200mMNaCl条件下,脯氨酸和甜菜碱含量上升。200mMNaCl条件下,油菜萌发种子中Na+含量显著增加,K+和Ca2+含量显著下降。种子萌发过程中,丙二醛含量增加,但盐胁迫下萌发种子中的丙二醛含量和相对电导率均增加。种子萌发过程中及盐胁迫下萌发种子中活性氧自由基含量升高。种子萌发过程中及100mMNaCl条件下,超氧化物歧化酶途径、过氧化氢酶途径、抗坏血酸-谷胱甘肽循环、谷胱甘肽过氧化物酶途径及过氧化物酶途径相关酶的活性升高,且抗坏血酸-谷胱甘肽循环底物含量也升高。200mMNaCl条件下,多数抗氧化酶活性与对照相比无差异或降低,且该条件下所有抗氧化酶活性均比400mM甘露醇处理下低。同时,我们利用蛋白质组学技术获得了成熟种子和萌发种子应答0、100和200mMNaCl胁迫的蛋白质表达谱。在成熟种子与萌发种子的双向电泳凝胶图中,获得了69个可重复的差异蛋白质斑点。经质谱鉴定分析,获得了59个鉴定结果,其中54个蛋白质斑点被鉴定为单一蛋白质,5个蛋白质斑点含有1种以上蛋白质。在萌发种子应答NaCl胁迫的双向电泳凝胶图中,获得了53个可重复的差异蛋白质斑点。经质谱鉴定分析,获得了50个鉴定结果,其中46个蛋白质斑点被鉴定为单一蛋白质,4个蛋白质斑点含有1种以上蛋白质。在种子萌发过程中,醛糖还原酶表达丰度增加,晚期胚胎丰富(LEA)蛋白表达丰度下降。在100mMNaCl条件下,LEA蛋白表达丰度下降。但在200mMNaCl条件下,该蛋白表达丰度与对照无明显差异。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化还原蛋白(Prx)和(DHAR)的表达丰度在种子萌发过程中增加,且SOD和乙二醛酶(GLO)的表达丰度在200mMNaCl条件下增加。种子萌发过程中,RNA加工及蛋白质命运相关蛋白的表达丰度增加。而在200mMNaCl条件下,热休克蛋白(HSP)70、含ACD结构域蛋白、20S蛋白酶体β亚单位表达丰度降低,但热休克同源蛋白(HSC)70.1、HSP101、线粒体加工肽酶(MPP)、HSC70-2、HSP60和HSP90表达丰度增加。此外,糖酵解相关酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和磷酸甘油酸激酶(PGK)以及三羧酸循环相关酶苹果酸脱氢酶(MDH)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)和乌头酸酶的表达丰度在种子萌发过程中增加。且在盐胁迫下,GAPDH和乌头酸酶的表达丰度也增加。在种子萌发过程中,甲硫氨酸合酶(MES)、腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)和腺苷高半胱氨酸合酶(AdoHcyase)的表达丰度增加,但盐胁迫下,这三种酶的表达丰度表现出多种变化。综合生理学和蛋白质组学结果我们得出如下结论：(1)盐胁迫下,萌发种子通过合成可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱维持细胞渗透平衡。在200mMNaCl条件下,油菜萌发种子中的离子稳态被打破、毒性显著增强。100mMNaCl处理下,油菜萌发种子中LEA蛋白降解无影响、有利于种子萌发。而200mMNaCl处理下,LEA蛋白降解可能受到抑制。(2)油菜萌发种子及100mMNaCl处理下的萌发种子通过SOD途径、CAT途径、AsA-GSH循环、GPX途径及POD途径清除ROS。SOD、Prx和DHAR的表达丰度增加表明它们清除ROS方面也具有重要作用。但200mMNaCl胁迫条件下主要通过GST途径和POD途径清除。GLO和SOD表达丰度增加有助于清除有害物质。(3)油菜萌发种子中RNA代谢和蛋白质命运相关过程均非常活跃。盐胁迫条件下,油菜萌发种子胞质蛋白质合成代谢和线粒体蛋白质合成代谢都参与应对盐胁迫。(4)油菜种子萌发过程中,可溶性糖被迅速动员,并通过糖酵解和TCA循环途径提供能量。盐胁迫条件下,油菜萌发种子中糖酵解途径中甘油醛-3-磷酸脱氢酶和TCA循环中乌头酸酶表达丰度增强,可能为应对盐胁迫提供能量。(5)油菜种子萌发过程中,甲硫氨酸循环活性增强。但盐胁迫条件下,油菜萌发种子中甲硫氨酸循环受到严重干扰,影响了种子的抗逆性。这些结果将为深入研究植物种子萌发过程中的耐盐机制提供了新的线索。
【作者】檀龙颜；
【导师】戴绍军；
【作者基本信息】东北林业大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】油菜；种子萌发；NaCl胁迫；生理学；蛋白质组学；

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