澳大利亚平脐蠕孢霉胆红素氧化酶的产生、特性及应用研究

【摘要】胆红素氧化酶(EC1.3.3.5),系多铜氧化酶家族中的一个成员,因其能催化胆红素氧化为胆绿素而得名。本文从玉米叶片病斑中分离出一株产胆红素氧化酶菌株,通过一系列的生物化学手段纯化出胞外胆红素氧化酶,继而对该酶生化、酶学、光谱学、电磁学、电化学特性及制作成酶电极检测血液中葡萄糖含量等应用作了研究,其结果如下：(1)胆红素氧化酶产生菌的分离与鉴定利用常规的微生物分离培养技术,从玉米叶片的病斑中分离出一株产胆红素氧化酶(BOD)的真菌。在原始发酵液中其酶活为1000U/L。通过形态学、生理学特征和rDNA-ITS(登录号为JN251106)序列分析,该菌株被鉴定为Bipolarisaustraliensis,命名为HD-1,属子囊菌门、格孢腔菌目、格孢腔菌科、平脐蠕孢属的澳大利亚平脐蠕孢霉(B.australiensis),亦称澳洲双孢霉,是一株没有被报道过的具有较高BOD酶活性的新菌株,为BOD的产生提供了新的资源。(2)产酶条件的优化通过单因素试验从供试的13种碳源、22种氮源中找到了适合B.aurtraliensisHD-1产生BOD的适宜碳源为麦芽糖、庶糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉及海藻糖。适宜的氮源有聚蛋白胨、大豆蛋白胨、豆饼粉。适宜的诱导剂为CuSO4。通过二水平部分因子试验及最陡爬坡试验设计,从碳源、氮源、诱导剂、培养温度、培养基初始pH及摇床转速七个因素中找到了对BOD产量影响最显著的三个因素即麦芽糖含量、发酵温度和CuSO4含量,通过最陡爬坡试验寻找到了逼近实验的中心点后,利用响应面法中的BB设计对上述三个主要因素进行优化,得到：当培养基质中初始组成含量(g/L)为：麦芽糖5,硫酸铜0.32,大豆蛋白胨50；发酵条件为：29.8℃,pH6.8,摇床转速为150rpm,发酵培养6d,可获得理论上最高酶活为2480U/L,验证实验酶活达到2180U/L,表明响应面法优化BOD的实验结果可靠,通过发酵条件的优化酶活比优化前提高了2.5倍。(3)酶蛋白的纯化和鉴定将B.aurtraliensisHD-1发酵液通过硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化后,经native-PAGE和SDS-PAGE检测,获得了具有BOD活性的电泳纯单体蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)法测定断裂后的蛋白质片段序列,获得135个氨基酸,利用Mascot软件在NCBI蛋白库中时行比对的结果表明,该蛋白与来源于Helminthosporiumtritici-vulgaris(燕麦长蠕孢霉)的漆酶前体蛋白序列同源性达100%。测定该酶蛋白表观分子量为68kDa,pI4.1。(4)光谱学和电磁学特性电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测得该酶含Cu,Zn,Fe原子,每分子BOD蛋白中含Cu、Zn、Fe原子的比率为1:1:4;UV-vis光谱学分析表明该蛋白具有典型多铜氧化酶家族的光谱学特性,即T1铜在600nm附近有一强吸收峰及T2、T3铜组成的三核铜中心在330nm附近有一肩(shoulder)状峰,所不同的是,该酶在340nm和773nm处各有一强吸收峰。电子顺磁共振(ESR)检测表明,酶在近中性(pH7.3)，-160℃条件下表现为静默状态。认为该蛋白是种新的胆红素氧化酶。(5)酶学特性不同底物的米氏常数(Km)值分别为Km(ABTS)=1.8×10-5(mol/L)(pH3.0)和Km(bilimbin)=2.7×10-5(mol/L)(pH7.5);该酶对胆红素的最适催化活性为36℃,酶在低温下稳定；在高pH下可保持相当高的催化胆红素活性；该BOD能够耐受高浓度的硝酸钠和尿素；低浓度的叠氮化钠和Trisbase对酶活有促进作用而高浓度则表现为抑制；该酶对氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、有机磷类农药及复合型农药百虫灵、溶解氧敏感。Cu2+和Hg2+在BOD不存在的条件下,二者可氧化胆红素为胆绿素,但产物不是唯一的；胆红素在BOD不存在时,可与溶液中的Li+、Na+、K+、Mn2+、Ba2+.Co2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Ca2+络合形成配合物,结合后的胆红素不能被酶催化。结合该酶的酶学及光谱学特性说明此酶为一新的胆红素氧化酶。(6)电化学特性及应用通过循环伏安法研究了BOD吸附在经羧基化的多壁碳纳米微管修饰的玻碳电极上的循环伏安曲线,表明在空气饱和的5mM柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系(pH7.3)中,获得了表观电势|△EP|=107mV(vs.SCE),|iPa/iPc|=0.7,证明体系发生了准可逆氧化还原反应,说明B.australiensisHD-1BOD与玻碳电极间发生了异源电子直接转移现象。利用羧基化的多壁碳纳米微管及Nafion膜溶液可有效增加玻碳电极的表面积,提高了吸附在电极上的酶量和电化学信号,延长了酶电极的使用时间,便于酶的直接电子转移。用该电极通过LSV法可快速地检测血样中微量葡萄糖浓度(0-15μM),且可信度较高,为该酶电极在临床上应用奠定了理论基础。
【作者】黄世臣；
【导师】赵敏；
【作者基本信息】东北林业大学，微生物学，2014，博士
【关键词】Bipolarisaustraliensis；胆红素氧化酶；酶学特性；电化学；酶电极；

【参考文献】
[1]王佩.建构主义翻译学视角下的外宣翻译[D].华中师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[2]吴南.未知环境下移动机器人的避障路径规划[D].沈阳工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[3]姚贵洪.刑讯逼供的遏制与防范[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[4]贾海华.产业集群环境下中小企业技术创新风险控制研究[D].郑州大学,科学技术哲学,2013,硕士.
[5]张毓格.牵引变电所二次设备隐藏故障在线诊断及预警[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[6]马锋胜.中国IT行业营销渠道与客户管理[D].武汉大学,2004.
[7]吴俊.商业智能打造企业竞争优势的利器[J].科学决策,2004,09:28-31.
[8]李杰,韦庆,常文森.基于对象阻抗控制的多机器人协调方法——模型、算法与实验[J].自动化学报,2002,03:349-355.
[9]周建旭.黄海潮间带海绵中蛋白质分离纯化及其活性初探[D].中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）,化学工程,2003,硕士.
[10]李锦绣.基于Logistic回归模型和支持向量机（SVM）模型的多分类研究[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[11]杨铁春,王攀峰,高豹,王琳,曹小红.磁性氧化石墨烯对水溶液中铀(Ⅵ)的吸附性能研究[J].江西化工,2013,04:153-158.
[12]李军.弹塑性状态下复合型疲劳裂纹扩展研究[D].北京理工大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[13]王钰.北京市大兴区青云店镇观光农业发展研究[D].内蒙古农业大学,农业经济管理,2013,硕士.
[14]罗娟.协同理论视角下高校非英语专业学生的听力策略培训研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[15]刘小玮.新疆北泰公司仓库管理系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[16]王玉艳.籽粒富锌水稻根际锌生物化学行为及其调控作用[D].浙江大学,植物营养学,2014,博士.
[17]王飞.盾构直接掘削大直径钢筋混凝土群桩研究[D].北京交通大学,2014.
[18]李东君.非晶合金微成形过程中的界面摩擦行为研究[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[19]杨德祥.微细通道内甲烷/湿空气催化着火特性研究[D].重庆大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[20]刘宗仁.C-E Translation of Abstracts in Academic Papers: A Functionalism Perspective[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[21]雷默涵.基于CE-Q强化学习与K-means聚类混合算法的多机器人觅食任务研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[22]靳志丽,杨清林,张芳.永州植烟土壤有效钙、镁、硫分布状况与聚类分析[J].作物研究,2014,06:638-641.
[23]戴雁行.全球化环境下的EL公司亚太区采购策略研究[D].上海外国语大学,工商管理,2013,硕士.
[24]王衍斐.基于GIS的义乌市浅层地温能评价模型研究[D].南京师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[25]闫瑞华.监测血尿酸在慢性肺源性心脏病患者中的临床价值[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[26]徐桂斌.中俄边境士兵思想政治素质培养问题研究[D].哈尔滨理工大学,思想政治教育,2012,硕士.
[27]侯思博.基于改进抽签法的机场时隙分配研究[D].南京航空航天大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[28]王进,徐小雷.非接触式方坯自动定尺切割系统[J].冶金自动化,2000,05:53-54.
[29]汪军.串联谐振感应加热逆变电源的研制[D].浙江大学,2006.
[30]杨效勇.关于天津钢管公司发展战略的思考[J].天津经济.2001(03)
[31]陆尤尤.基于“压力—状态—响应”机制的江苏省农业面源污染研究[D].南京农业大学,生态学,2012,硕士.
[32]张文.地铁换乘枢纽拥挤度识别及预警调控研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[33]潘凯丽.文化增补策略在小说翻译中的运用[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[34]李航.大学生英语写作自我效能感量表的编制[J].北京第二外国语学院学报,2014,12:70-76.
[35]莫逆,周冠宇,杨露.基于客流流线的地铁站检票闸机布设研究[J].城市轨道交通研究,2014,05:17-21.
[36]樊晓慧.α-二亚胺配体钴金属有机化合物的合成及性质研究[D].西北大学,材料化学,2013,硕士.
[37]张颍.基于国际医学教育标准异同比较的岭南医学教育标准研究[D].南方医科大学,社会医学与卫生事业管理,2012,硕士.
[38]姚晓云.鹿茸微粉碎工艺及新产品的开发研究[D].吉林大学,食品科学与工程,2014,硕士.
[39]程婉君.一个财务共享系统的设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[40]刘善华.高速铁路隧道洞口缓冲结构数值模拟及模型试验研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[41]张士廉.基于多智能体的集成化供应链管理系统[A].中国自动化学会智能自动化专业委员会、昆明船舶设备集团公司、云南自动化学会、中国人工智能学会计算机视觉及智能控制学会、IEEE控制系统学会北京分会、中国自动化学会机器人竞赛工作委员会.2001年中国智能自动化会议论文集（下册）[C].中国自动化学会智能自动化专业委员会、昆明船舶设备集团公司、云南自动化学会、中国人工智能学会计算机视觉及智能控制学会、IEEE控制系统学会北京分会、中国自动化学会机器人竞赛工作委员会:,2001:5.
[42]石一辉,乔颖,闵勇,鲁宗相,陈惠粉.考虑定子侧暂态过程的双馈感应发电机转子电流解耦控制[J].电力系统自动化,2011,03:77-82.
[43]肖国炜.“金理财”系列集合资产管理计划投资组合分析[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[44]李世华,田玉平.非完整移动机器人的轨迹跟踪控制[J].控制与决策,2002,03:301-305.
[45]李云柯.“营改增”政策对现代物流业的涉税影响和应对措施研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[46]周杨.Si的渗透和掺杂对AZO薄膜结构和特性的影响[D].苏州大学,等离子体物理,2013,硕士.
[47]刘芷滔.严格成对不平衡可分组设计[D].北京交通大学,2014.
[48]吕柳莹.中国古代典雇婚姻的法史探讨[D].复旦大学,法制史,2012,硕士.
[49]潘良云,李明杰,王小善,张宏伟,张军勇,孙星,孙学栋.酒泉盆地典型传递带构造特征及控油作用[J].石油地球物理勘探,2013,03:458-466+506+331.
[50]周露.基于Demons算法的变形图像配准技术的研究[D].南方医科大学,生物医学工程,2012,硕士.