芽孢杆菌漆酶基因的克隆表达与分子定向进化

【摘要】漆酶(laccase),是一种典型的绿色催化剂,应用范围广泛。目前工业化的漆酶商品主要来源真菌发酵。但在高温、高盐或强碱性等极端环境中,真菌漆酶易失活,限制了其应用范围。相比之下,细菌漆酶具有耐高温、耐高碱性的优势,且发酵生产周期短,具有广阔的推广前景。为获得生产周期短,活性高的细菌漆酶,本文克隆了芽孢杆菌属的漆酶基因,并在大肠杆菌中进行了原核表达,利用分子定向进化手段获得表达量高、热稳定性较好、碱性环境耐受力较强的细菌漆酶突变株,并研究了突变漆酶的酶学特性和空间结构,在此基础上又进行了突变漆酶降解染料的研究,获得如下研究结果：(1)扩增解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensLS05)和枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisLS03)的漆酶基因。比对基因序列的同源性为74%,氨基酸序列同源性为77%。B.subtilisLS03cotA基因序列全长1542bp编码514个氨基酸残基,运用生物信息学方法推测其分子量58.5kDa。将B.subtilisLS03cotA漆酶基因与表达载体pETDuet-1连接构建重组表达质粒并转入表达宿主细胞,构建了野生型重组CotA漆酶,经低温微好氧环境诱导表达,重组CotA蛋白表现出漆酶的催化活性。表达产物存在于菌体破碎后的上清液中,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得62kDa的目的蛋白,测得其比酶活为1.44U/mg。酶学性质研究表明,纯蛋白催化两种底物的最适反应pH为4.0(ABTS)和7.0(SGZ),在中性和碱性环境下酶活稳定性良好；最适反应温度60℃(SGZ)。低浓度Mg2+、Cu2+、Na+对野生型重组CotA漆酶活性有促进作用；10%浓度的有机溶剂可以维持漆酶活性60%以上；常规蛋白抑制剂能够抑制漆酶的活性；与底物丁香醛连氮(SGZ)具有较好的亲和性。(2)运用易错PCR向枯草芽孢杆菌属漆酶基因引入随机突变点作为下一轮FamilyShuffling的多样性母本同源基因,通过FamilyShuffling技术构建随机突变库,利用96孔板初筛和大量发酵复筛,最终获得三个酶活性和热稳定均提高的突变漆酶：CotA-46、CotA-120和CotA-183。其中CotA-46纯酶的比酶活7.49U/mg,比野生型提高5倍；其最适反应温度为70℃比野生型提高10℃；同时表现出较好的热稳定性,较高的催化效率及较强的底物(SGZ)亲和力。同源建模获得的突变漆酶三维结构表明三个突变漆酶的相应氨基酸突变位点均位于酶分子表面或Loop区域,且大部分位于CotA蛋白的第三结构域。(3)对B.subtilisLS03漆酶的结构域进行分子定向进化,通过易错PCR技术分别构建三个结构域突变文库,以SGZ为底物的酶活为筛选指标,最终获得两株酶活提高的结构域突变漆酶(LS03-CotA-50和LS03-CotA-76)。同源建模分析发现由于突变氨基酸位点分别定位于第二和第三结构域,且均远离催化中心,因而结构域突变漆酶的酶学特性变化不大,LS03-CotA-76的最适温度70℃,其热稳定性和催化效率也略有提高。(4)突变漆酶对四类化学结构类型不同的合成染料的脱色效率均高于野生漆酶,效果最为显著的是CotA-46。无介体参与时,该突变漆酶对9种合成染料的脱色率介于34-89%,随着脱色体系中介体的加入使各染料脱色率迅速提高2-3倍。当脱色蒽醌染料茜素红时,无介体参与CotA-46突变漆酶的脱色率为34.6%与介体乙酰丁香酮(ACE)参与野生型重组CotA漆酶的脱色率基本相同。对于模拟染料废水的脱色,CotA-46突变漆酶在酸性环境中最高脱色率可达40%；中性环境和碱性条件下介体漆酶脱色体系可使染料废水的最大脱色率提高到87%。
【作者】欧阳凤菊；
【导师】赵敏；
【作者基本信息】东北林业大学，微生物学，2014，博士
【关键词】细菌漆酶；CotA蛋白；定向进化；酶学性质；染料脱色；

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