拟南芥核糖核酸酶YbeY参与叶绿体rRNA加工的功能研究

【摘要】叶绿体核糖体(Chlororibosomes)是叶绿体编码基因的蛋白质合成的场所,由30S和50S两个核糖体亚基构成的70S核糖体。30S的核糖体小亚基由16SrRNA和20种核糖体蛋白组成,50S的核糖体大亚基由23S、4.5S5SrRNA与30种核糖体蛋白组成。高等植物叶绿体的四个核糖体RNAs(16S、23S、4.5S和5SrRNA)来源于同一个操纵子,作为多顺反子转录成rRNA前体,再经过加工形成成熟的rRNAs。叶绿体成熟rRNA是其核糖体翻译活性所必要的,一些加工因子和5个核糖核酸酶被报道参与叶绿体rRNA加工和成熟。然而,对于叶绿体rRNA加工和成熟过程及分子模式,人们知道的仍是非常有限。本研究鉴定一个新的核糖核酸酶YbeY参与植物叶绿体rRNA加工和成熟,并影响叶绿体发育。主要研究结果如下：(1)基因数据库同源序列搜索表明,35个已知基因组植物物种均存在和细菌YbeY同源的蛋白,数量1-2个,这些植物YbeY蛋白大多数含有UPF0054和HADhydrolase-like双结构域,少数的仅含有UPF0054结构域。氨基酸序列一致性分析显示,含有双结构域的植物YbeY大多数含有H3xH5xHmotif,而只含UPF0054结构域的植物YbeY基本没有此motif。这表明YbeY蛋白在植物中既有保守性,又显示了进化上的新特征。(2)拟南芥基因组只存在一个YbeY蛋白(At2g25870),GFP分子荧光蛋白标记手段显示AtYbeY定位于拟南芥叶绿体。半定量PCR和荧光定量PCR数据显示,AtYbeY基因在拟南芥所有组织中均有表达,在莲座叶和花中较高表达；此外,AtYbeY基因转录表达水平受光调控,但不受热激诱导。(3)遗传学数据显示,与野生型相比AtYbeY基因下调突变体(atybeY-1和AtYbeY-amiRNA)表现为叶色发黄,生长迟缓,AtYbe]基因敲出突变体(atybeY-2)表型为白化致死。这些结果表明AtYbeY对于拟南芥存活和光合自养是必须的。(4)生理生化数据显示,atybeY-1突变体总叶绿素、叶绿体a和b含量及叶绿素a/b比都下降,叶绿素荧光参数Fv/Fm和ETRⅡ显著下降而qN升高。这些生理指标表明atybe突变体光合效率降低。超微结构显示atybeY-1突变体叶绿体基粒和基质类囊体均显著减少,表明其叶绿体发育存在缺陷,(5)用BN-PAGE技术分析显示,atybeY-1突变体光合色素复合体PSⅡ超复合体和PSI单体/PSⅡ双体明显减少；SDS-PAGE分析显示RbcL含量显著下降；Western杂交数据显示叶绿体编码的类囊体复合体亚基蛋白含量显著下降；Northern杂交数据显示叶绿体编码基因的转录水平不受影响。这些结果表明AtYbeY突变影响叶绿体编码基因的翻译水平。(6)Northern杂交数据显示atybeY-1突变体的16S、23S、4.5S和5S叶绿体4种rRNA前体显著积累,而成熟转录产物明显减少,用5’和3’端特异性探针杂交进一步显示前体16S和23SrRNA产物积累。cRT-PCR分析显示16S、23S和4.5SrRNA的5’和3’端序列未被加工切去。这些结果表明AtYbeY参与叶绿体16S、23S、4.5S和5SrRNA加工和成熟。此外,atybeY-1突变体内叶绿体rRNA操纵子的tRNA成熟产物也明显减少,表明AtYbeY也参与这三个tRNA成熟加工。(7)rRNA定量分析显示,atybeY-1突变体内16SrRNA成熟加工的缺陷影响了叶绿体核糖体30S小亚基装配,成熟23SrRNA的减少也影响了叶绿体核糖体50S大亚基组装。多聚核糖体与mRNA结合实验显示,AtYbeY突变降低叶绿体mRNA与多聚核糖体结合数量。这些结果表明AtYbe基因突变影响叶绿体核糖体的功能。(8)体外生化数据显示,AtYbeY剪切叶绿体编码的rRNA,mRNA和tRNA,但不能降解dsDNA和ssDNA,表明AtYbeY是一个核糖核酸酶(RNase)
【作者】刘金文；
【导师】刘桂丰；程玉祥；
【作者基本信息】东北林业大学，林木遗传育种，2014，博士
【关键词】YbeY；叶绿体；rRNA加工；核糖体；翻译；拟南芥；

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