RafX蛋白介导的肺炎链球菌磷壁酸细胞壁连接机制及其毒力机制研究

【摘要】目的肺炎链球菌的磷壁酸（teichoicacids，TA）是主要毒力因子之一，对细菌在宿主体内外生存具有重要意义。肺炎链球菌依赖磷壁酸维持菌体表面阳离子环境稳定；同时，肺炎链球菌利用磷壁酸胆碱基团为胆碱结合蛋白提供锚定位点等。生物信息学分析提示肺炎链球菌磷壁酸生物合成是多蛋白参与的复杂代谢过程。磷壁酸共价连接至细胞壁是完整细菌细胞壁的关键环节，但其机制目前尚不清楚。本课题组前期研究显示RafX（SPD1672）可能与磷壁酸代谢相关，但rafX基因特点、rafX基因缺失对细菌表型的影响、RafX蛋白相关特征、RafX蛋白在磷壁酸代谢中的功能及其毒力机制仍有待深入研究。方法利用生物信息学软件或数据库分析rafX基因在基因组中的位置及其相关功能，利用RT-PCR的方法了解rafX基因的转录特征。ΔrafX缺陷菌体外培养，以了解rafX基因对细菌表型影响；利用光学显微镜和透射电镜观察rafX基因缺陷株细菌形态学特征；通过构建RafX-GFP融合蛋白并利用激光共聚焦和Westernblotting分析RafX蛋白的亚细胞定位。在第二部分实验中，首先利用不同处理方法，包括2%胆碱洗脱、5%SDS处理、蛋白酶K水解、构建lgt缺陷菌、溶菌酶和变溶菌素水解、脱氧胆酸盐水解研究磷壁酸分子特征。在获得相关基础信息后，利用Westernblotting检测rafX基因缺陷株磷壁酸的改变，利用FACS技术检测细菌表面磷壁酸含量。运用生物信息学软件分析RafX胞外活性环（EL4）的连接酶作用，利用丙氨酸定点突变技术研究EL4结构域及关键氨基酸以证实RafX蛋白的连接酶功能。利用PCR方法扩增20多种不同ST肺炎链球菌临床菌株，并利用Westernblotting分析临床菌株磷壁酸条带分布和含量，以明确RafX蛋白介导的磷壁酸代谢保守性。最后，通过粘附实验，腹腔和鼻腔攻毒实验研究磷壁酸在粘附和毒力中的作用。结果生物信息学分析提示RafX蛋白具有O-抗原连接酶功能。rafX基因与其上游基因gtfA共转录。相比野生D39菌株，D39ΔrafX缺陷株血平板生长后菌落较小；D39ΔrafX缺陷体外培养表现为生长迟缓、自溶提前、平台期缩短等现象；光学显微镜和电镜下可见D39ΔrafX缺陷菌链变短；另外，电镜下可见D39ΔrafX缺陷菌分裂和形态异常。尽管如此，细菌对DOC的敏感性相同，与自溶相关的自溶酶A（lytA）总量和表面含量相同。利用GFP标签蛋白对RafX蛋白进行亚细胞定位分析得到，RafX蛋白位于细胞膜上，蛋白N端和C端均位于胞内。本研究发现利用不同的分析方法包括2%胆碱洗脱、SDS处理、溶菌酶和变溶菌素水解、脱氧胆酸盐水解所分析的成分为壁磷壁酸（WTA）与肽聚糖（PG）复合物（WTA-PG），而非文献报道的脂磷壁酸（LTA）。蛋白酶K水解、构建lgt缺陷菌并不改变磷壁酸条带，溶菌酶过度水解条带分子量变小进一步证实所分析的磷壁酸成分为WTA-PG复合物。Westernblotting分析发现RafX缺陷细菌WTA-PG条带异常，含量降低。FACS和ELISA方法证实RafX缺陷菌表面磷壁酸含量降低，这些结果提示RafX与细菌表面磷壁酸含量有关。PCR结果显示，所有20多种ST型细菌临床菌株均表达rafX基因，同时测序结果发现rafX基因DNA序列保守性超过99.9%。另外，所有临床菌株均有磷壁酸特征条带，无条带后移现象。MolegroVirtualDocker软件对EL4环和截断的磷壁酸前体分子（C14H26O7P2）进行分子对接模拟提示，磷壁酸前体分子能以配体的形式与EL4环的Arg260与His304、His306形成氢键，能被RafXEL4结构域结合，提示RafX可能具有磷壁酸连接酶功能。丙氨酸惰性替代研究证实RafX蛋白的连接酶功能，研究发现H151、R154、R266、W270、G284、P287、H304A和H306是RafX蛋白酶活性的关键氨基酸。体外粘附实验显示，Anti-CWPS抗血清能够显著抑制野生R6对MLE12和HUVEC细胞的粘附，提示磷壁酸分子本身与细菌粘附密切相关。而缺陷rafX后，R6的粘附能力仅为野生菌株的10-15%，这与rafX影响磷壁酸的连接结果相吻合。RafXΔEL4、H306A突变体回复的R6ΔrafX菌株其粘附能力仍与R6ΔrafX菌株相同，而RafXH106A突变体回复的R6ΔrafX菌株其粘附能力与野生R6相同，说明细菌粘附能力的变化与RafX蛋白本身无关。流式细胞术分析显示，R6和TIGR4ΔrafX细菌表面的CbpA显著下降，提示CbpA的表达下调与rafX缺陷菌粘附能力的下降有一定关系，这也与rafX缺陷菌磷壁酸减少导致细菌表面胆碱减少的结果相吻合。小鼠感染野生RafX、RafXH106A和RafXWL回补菌后全部死亡，而感染ΔrafX和RafXH306A回补菌的小鼠存活率显著延长，感染D39的小鼠肺组织出现了典型的出血、坏死，大量炎性细胞浸润等改变，而感染D39ΔrafX的缺陷菌，小鼠肺部炎症反应较轻，未见明显的出血坏死等病灶，提示磷壁酸在细菌毒力中的重要作用。此外，感染缺陷菌小鼠的鼻咽部、肺、脑和血液中的细菌载量显著低于野生细菌，进一步说明磷壁酸与细菌的粘附和侵袭性疾病的发生有关。为了明确细菌毒力变化是由其生长缺陷还是对天然免疫细胞抵抗减弱所致，我们将D39和D39ΔrafX培养至兔血清、兔抗凝全血或分别与中性粒细胞和巨噬细胞共同孵育，结果显示，ΔrafX缺陷菌在兔血清中的生长显著减缓；然而，相比野生D39，ΔrafX缺陷菌抵抗天然免疫细胞杀伤能力并无显著差异，提示D39ΔrafX生长缺陷是导致细菌毒力变化主要原因。结论rafX基因缺陷影响细菌生长、自溶、细菌形态和分裂。RafX可能是一种连接酶参与肺炎链球菌磷壁酸胞外连接。RafX介导的磷壁酸代谢在亲缘性高的链球菌属细菌中有一定保守性。磷壁酸本身是一种重要的非蛋白粘附素，同时也能影响粘附相关蛋白如CbpA蛋白表面的分布，协同影响细菌粘附。RafX缺陷菌其毒力下降主要与其生长缺陷和表面毒力因子表达下调有关。
【作者】吴凯峰；
【导师】尹一兵；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】肺炎链球菌；磷壁酸；连接酶；RafX蛋白；

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