NEDD9在上皮性卵巢癌恶性生物学行为中的作用及机制的初步研究

【摘要】卵巢癌是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，其中，上皮性卵巢癌（Epithelialovariancancer，EOC）是卵巢癌最常见的病理类型，约占所有卵巢癌的80%以上。因为卵巢深藏于盆腔，早期发生病变时，患者往往无症状，且由于缺乏早期诊断卵巢癌的有效方法，导致70-75%的患者就诊时已属晚期，已出现了广泛的盆腹腔扩散或远处转移。尽管理想的肿瘤细胞减灭术及铂类为基础的联合化疗方案对卵巢癌患者有效，但治疗效果差，复发率高，且易产生化疗药物耐药，迄今为止，卵巢癌患者的5年生存率仍徘徊在30%左右。卵巢癌的侵袭转移和化疗耐药是临床治疗卵巢癌的难点。因此，寻找高敏感性和特异性的生物学标记物对于阐述调控卵巢癌发生发展的分子网络机制具有十分重要的价值。NEDD9(Neuralprecursorcell–expressed,developmentallydown-regulated9)属于接头分子CAS家族中的一员，是一种骨架蛋白，定位于黏着斑，它在介导细胞信号转导中发挥重要作用，能通过调节蛋白复合体调控细胞的粘附、迁移和侵袭、趋化作用、凋亡/失巢凋亡和细胞周期等诸多生物学行为。现有证据表明，NEDD9是恶性肿瘤的促转移基因，其高表达与多种恶性肿瘤的不良预后相关，如黑色素瘤、乳腺癌和头颈部鳞癌等。已有国外研究小组通过基因芯片筛选出NEDD9是晚期浆液性卵巢癌与早期浆液性卵巢癌差异表达的基因，但未进一步验证。NEDD9蛋白在卵巢癌中的表达及作用目前尚无从得知。因此，本课题将通过以下三部分的研究初步探讨NEDD9在EOC中的表达和临床意义，及其在EOC恶性生物学行为中的作用及机制，以期为早期诊断和基因靶向治疗EOC提供新的靶点。第一部分NEDD9在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义目的：检测NEDD9在EOC组织和细胞中的表达，并分析NEDD9的表达水平与EOC患者临床病理特征和预后的关系。方法：（1）采用免疫组化法检测NEDD9蛋白在129例EOC、18例卵巢交界性囊腺瘤、22例卵巢良性囊腺瘤及15例正常卵巢组织石蜡标本中的表达，并分析NEDD9蛋白表达水平与EOC患者临床病理特征的相关性。（2）采用Westernblotting法检测NEDD9蛋白在28例EOC、10例卵巢交界性囊腺瘤、14例卵巢良性囊腺瘤及10例正常卵巢组织新鲜冰冻标本中的表达。（3）采用Kaplan-Meier法分析NEDD9蛋白表达水平对EOC患者生存时间的影响，并采用COX回归分析探讨影响EOC患者生存时间的因素。（4）采用Westernblotting检测NEDD9蛋白在不同EOC细胞株（SKOV3、OVCAR-3、3AO、A2780）中的表达，并采用免疫荧光法分析NEDD9蛋白在EOC细胞中的定位。结果：（1）免疫组化结果显示，NEDD9在129例EOC组织中广泛表达（高表达：69.0%，低表达：31.0%）；而在正常卵巢组织、卵巢良性囊腺瘤组织及卵巢交界性囊腺瘤组织中表达很低甚至不表达，其阳性表达率依次为：6.7%，13.6%，16.7%，与EOC相比，差异均有统计学意义（P<0.01）。在EOC组织中，NEDD9蛋白在FIGOIII/IV期组织中的表达高于在FIGOⅠ/Ⅱ期组织中的表达（P＜0.001）、在中低分化肿瘤组织（G2/G3级）中的表达高于在高分化肿瘤组织（G1级）中的表达（P＜0.001）、在术后残余肿瘤直径≥1cm组织中的表达高于在术后残余肿瘤直径＜1cm组织中的表达（P=0.028），但其表达水平与EOC患者诊断时的年龄，血清CA125水平，腹水量及病理类型无关（P＞0.05）。（2）Westernblotting结果显示，NEDD9蛋白在EOC组织中的表达（1.46±0.26）明显高于其在正常卵巢（0.52±0.06；P＜0.01）、卵巢良性囊腺瘤（0.52±0.11；P＜0.01）和卵巢交界性囊腺瘤（0.68±0.12；P＜0.01）组织中的表达。（3）Kaplan-Meier分析结果显示，NEDD9蛋白高表达的EOC患者的总生存期/疾病无进展生存期明显短于NEDD9蛋白低表达的EOC患者（P＜0.001），多因素COX回归分析表明：NEDD9蛋白高表达（HR=2.006，P=0.033）、FIGO分期晚（HR=8.786，P＜0.001）、肿瘤组织分化差（HR=11.210，P=0.01）仍是EOC的独立预后因子。（4）NEDD9在SKOV3，OVCAR-3和3AO三种细胞株中表达较高，而在A2780细胞中表达较低。免疫荧光结果显示，NEDD9蛋白主要表达于细胞的胞浆及胞膜。结论：NEDD9蛋白在EOC组织中高表达，其高表达与EOC患者的FIGO分期晚、肿瘤组织病理分化差、不理想的肿瘤细胞减灭术及患者的不良预后相关，提示NEDD9可能在调控EOC的发生发展中具有重要作用。NEDD9在EOC细胞株中的表达不同，可能与细胞的侵袭转移能力相关。第二部分NEDD9shRNA慢病毒载体的构建及稳定转染SKOV3细胞的筛选目的：构建靶向沉默NEDD9基因的慢病毒载体，并建立稳定转染NEDD9shRNA慢病毒的SKOV3细胞株，为进一步的细胞功能学研究奠定基础。方法：（1）设计并合成四条靶向沉默NEDD9shRNA序列（NEDD9shRNA-1，-2，-3，4）和一条阴性对照序列，连接入线性化的慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，DNA对阳性克隆进行测序鉴定。（2）将测序鉴定正确的重组质粒与Lipofectamine2000共转染293T细胞后，收获上清并浓缩、测定滴度。（3）按MOI=40转染SKOV3细胞，转染72h后收获细胞，采用Real-timePCR法检测NEDD9mRNA的表达，初步筛选干扰效果最佳的靶点。（4）利用干扰效果最佳的靶点慢病毒建立稳定转染的SKOV3细胞，并采用Real-timePCR和Westernblotting分析稳定转染后SKOV3细胞中NEDD9mRNA和蛋白的表达。结果：（1）设计并成功合成四条NEDD9shRNA干扰序列和一条阴性对照序列。DNA测序鉴定表明成功构建了NEDD9shRNA慢病毒重组质粒。（2）慢病毒转染SKOV3细胞72h后的PCR结果显示，NEDD9shRNA-4靶点干扰效果最佳。（3）利用嘌呤霉素成功筛选出稳定转染NEDD9shRNA-4慢病毒载体的SKOV3细胞株，并且Real-timePCR和Westernblotting分析结果显示NEDD9mRNA和蛋白的表达均明显被抑制。结论：成功构建并筛选出高效靶向干扰NEDD9基因的慢病毒表达载体（NEDD9shRNA-4），并成功建立稳定转染的卵巢癌SKOV3细胞株，为进一步研究NEDD9调控卵巢癌SKOV3细胞恶性行为的作用及机制奠定基础。第三部分NEDD9shRNA对卵巢癌SKOV3细胞恶性生物学行为的影响及机制初步探讨目的：观察NEDD9基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞恶性行为的影响，初步探讨NEDD9参与卵巢癌发生发展的分子机制。方法：将NEDD9基因沉默前后的SKOV3细胞分为三组，即未转染的SKOV3细胞为SKOV3-CON组；稳定转染无关序列的SKOV3细胞为SKOV3-NC组；稳定转染沉默NEDD9基因的SKOV3细胞为SKOV3-KD组。（1）采用粘附实验观察NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞粘附能力的变化。（2）采用Transwell迁移和侵袭实验观察NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞迁移和侵袭能力的变化。（3）采用MTT实验和平板克隆实验观察基因沉默前后SKOV3细胞克隆增殖能力的变化。（4）采用Westernblotting法检测NEDD9基因沉默前后SKOV3细胞中E-cadherin、MMPs及ERK1/2和p38MAPK信号通路相关蛋白表达的变化。结果：（1）粘附实验结果显示，NEDD9基因沉默使SKOV3细胞的同质粘附能力增强，异质粘附能力减弱。（2）NEDD9基因沉默抑制卵巢癌SKOV3细胞的体外迁移和侵袭能力：Transwell迁移实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组的穿过聚碳酸脂膜的迁移细胞数明显减少（P＜0.05）。Transwell侵袭实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组穿过Matrigel基质胶的侵袭细胞数明显减少（P＜0.05）。（3）NEDD9基因沉默降低卵巢癌SKOV3细胞的体外增殖能力：MTT实验结果显示，观察培养0-7d后，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组细胞生长曲线相对平缓，细胞生长增殖明显收到抑制（P＜0.05）平板克隆实验结果显示，与SKOV3-CON组和SKOV3-NC组相比，SKOV3-KD组细胞的克隆形成数目明显减少（P＜0.05）。（4）Westernblotting结果显示，NEDD9基因沉默后，SKOV3细胞中E-caherin表达增加，MT1-MMP、MMP-2和P-ERK1/2表达减少，而MMP-9和p38MAPK信号通路相关蛋白的表达则无变化。结论：NEDD9基因沉默增强了卵巢癌SKOV3细胞的同质粘附能力，降低了异质粘附能力，抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力；NEDD9可能通过调控ERK1/2信号通路的活性介导EOC的恶性生物学行为。
【作者】王海霞；
【导师】唐良萏；
【作者基本信息】重庆医科大学，妇产科学（专业学位），2014，博士
【关键词】NEDD9；上皮性卵巢癌；预后；侵袭；转移；RNA干扰；shRNA；增殖；信号通路；

【参考文献】
[1]钱粉红.下呼吸道感染细菌及临床研究[D].苏州大学,呼吸内科学,2003,硕士.
[2]徐小庆.微博在大学生思想政治教育中的功能探析[D].首都师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[3]赵晶.杨梅素对DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的保护作用研究[D].吉林大学,药理学,2013,硕士.
[4]李建平.论大学生人文精神及其培养[D].复旦大学,思想政治教育,2012,硕士.
[5]吴晓东.水位和收割对沉水植物生长的影响研究[D].南京师范大学,资源科学,2012,硕士.
[6]刘娇.生命化美术教育理念及其实现途径初探[D].湖北大学,课程与教学论,2012,硕士.
[7]姜加龙.插电式同轴并联混合动力系统匹配仿真研究[D].燕山大学,车辆工程,2014,硕士.
[8]管征.宪法基本权利之私人效力[D].中国政法大学,宪法学与行政法学,2004,硕士.
[9]陈洁.超声弹性成像参数在乳腺病变诊断中的研究[D].复旦大学,影像医学与核医学,2012,硕士.
[10]王燕.支架式教学模式在ESP课程中的实践研究[D].安徽大学,英语语言文学,2014,硕士.
[11]张毓雄.我国企业员工持股计划研究[D].湘潭大学,政治经济学,2001,硕士.
[12]李卫东,宋威,杨炳儒.利用数据挖掘方法分析客户生涯价值[J].计算机工程与应用,2005,06:17-18+36.
[13]高开娟.大股东控制权与股权激励效果研究[D].华中科技大学,企业管理,2012,硕士.
[14]段国凡.基于GIS的降雨情况下高边坡稳定性智能区域评估研究[D].重庆大学,土木工程,2014,硕士.
[15]陶焕涌.市场经济条件下大学生思想价值观念倾向和教育措施刍议[J].南京理工大学学报(社会科学版).1994(03)
[16]彭霖.掺杂BFO薄膜的制备及光学、电学和磁学性质研究[D].华东师范大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[17]吴亢.高海拔地区的民用燃气灶燃烧与热工特性研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[18]陈兴.光整流法产生太赫兹辐射强度与转换效率的理论研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2014,硕士.
[19]周保卫.MIMO检测技术研究及其在LTE系统中的应用[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[20]万凯.第二次土地调查数据整合及成果应用研究[D].内蒙古师范大学,土地资源管理,2012,硕士.
[21]徐瑞哲,张梦然,孙锲.2010年诺贝尔自然科学奖花落谁家?[J].今日科苑,2010,22:67-70.
[22]刘香梅,王增波.大型工业以太网在焦化厂的应用[J].冶金自动化,2011,04:61-64.
[23]侯玲.类似必要共同诉讼制度研究[D].南京师范大学,诉讼法学,2012,硕士.
[24]杨阳.基于ISO9000的知识管理系统研究[D].天津大学,2003.
[25]梁培培.无机半导体共同敏化TiO_2薄膜的制备和光电转换性质[D].华东师范大学,无机化学,2013,硕士.
[26]韩琳琳.提升小学高年级学生幸福感的对策研究[D].鲁东大学,教育管理（专业学位）,2013,硕士.
[27]朱雷.砌体墙板与静压管桩反应分析的支持向量机方法[D].哈尔滨工业大学,固体力学,2013,硕士.
[28]关庆涛.不同氧化程度的氧化石墨烯对铀的吸附行为研究[J].环境与生活,2014,12:167-168.
[29]李伟力,程鹏,吴振兴,刘玉宝,邱洪波.并网永磁同步发电机转子永磁体局部失磁特征量的计算与分析[J].中国电机工程学报,2013,33:95-105+12.
[30]陈梦真.20世纪末21世纪初印尼政治转型问题研究[D].广西师范大学,政治学理论,2013,硕士.
[31]杨勇.通信基站建设中的物权保护[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[32]付小红.健美操教学对内蒙幼师女学生心理健康状况影响的研究[D].内蒙古师范大学,心理健康教育（专业学位）,2013,硕士.
[33]张奉君.休谟正义观述评[D].中共中央党校,外国哲学,2004,硕士.
[34]贺建沛.WSN节点定位算法的研究与实现[D].北方工业大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[35]田坤.以农民工为劳动者的劳资关系研究[D].天津商业大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[36]戴莉萍.基于语料库的湖南省高考英语阅读理解测试内容效度研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[37]石宝彩.大学生体质健康状况追踪研究[D].西北师范大学,体育人文社会学,2014,硕士.
[38]林乐毅.新时期公安队伍建设研究[D].大连理工大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[39]杨展.宁波妈咪宝婴童用品制造有限公司薪酬体系设计研究[D].长沙理工大学,人力资源管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]谢赣南.团队管理成熟度评价体系在土建工程项目中的应用研究[D].西南交通大学,项目管理,2012,硕士.
[41]吴纪忠.基于供应链视角ZQ集团营运资金管理研究[D].哈尔滨工业大学,会计,2014,硕士.
[42]马艺玮,杨苹,王月武,赵卓立.微电网典型特征及关键技术[J].电力系统自动化,2015,08:168-175.
[43]张芙蓉.激光深熔焊过程熔池流动特性数值模拟与分析[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2014,硕士.
[44]潘艳艳.高校志愿服务发展研究[D].苏州大学,社会学,2013,硕士.
[45]孙宏丽.基于Internet变电站自动化软件的研究与实现[D].西安理工大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[46]周玲.网络征婚广告的顺应研究[D].湖南师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[47]吴焱明,年夫来,赵松丽,吴天星,朱家诚.油箱焊接平台控制系统的设计与研究[J].机械工程与自动化,2015,02:163-164+167.
[48]谢方军,唐常杰,元昌安,左劼,陈安龙.基于基因表达式的演化硬件进化和优化算法[J].计算机辅助设计与图形学学报,2005,07:1415-1420.
[49]刘阳.社会福利基金的筹资模式研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2013,硕士.
[50]张峦峦.现代教育技术优化高中生物课堂教学行为的研究[D].辽宁师范大学,现代教育技术（专业学位）,2012,硕士.