儿童感染乙型肝炎病毒基因组部分区段突变分析

【摘要】乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）感染是全球普遍的公共卫生问题，我国尤为严重。在HBV感染过程中，由于病毒自身的特殊复制方式，加上机体的免疫选择压力、抗病毒药物以及疫苗诱导等因素的作用下，HBV基因组很容易发生变异，导致免疫逃逸或耐药。同时某些关键位点的突变可能还与病毒的复制水平、疾病的严重程度及进展和预后等相关。HBV各个基因区段均可发生突变，自然发生的突变可分布于HBV整个基因组，而经过压力选择的变异可能主要位于免疫攻击的表位、药物作用的靶位或病毒复制的调控区，其中基本启动子区、前C区和S抗原a决定簇等部位是突变发生率较高的区段，也是HBV基因变异研究的热点。本研究对中国南方地区较大样本量的慢性HBV感染儿童患者以及成人对照患者血清样本，采用直接测序的方法检测了启动子区/前C区、C基因区及S区核苷酸序列的突变情况，并比较分析了C基因区及S区推导氨基酸的突变特征，探讨在分析区段序列的突变与HBeAg状态、免疫表位、HBV基因型、血清DNA载量、ALT水平和年龄等资料间的关系。主要结果及结论如下：1.儿童及成人HBV感染患者均以B基因型为主，约占75.0%，C基因型约占25.0%。2.BCP/PC区突变情况：我们在儿童患者中检出7个与HBeAg状态显著相关的突变位点，其中ntT1753G/C、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A突变主要见于HBeAg阴性患儿，而ntA1752G突变主要见于HBeAg阳性患儿。在成人患者中检出ntA1846T、G1896A、G1899A、A1762T、G1764A五个与HBeAg阴性状态相关的位点。7个突变位点中，仅发现A1762T/G1764A双突变在HBeAg阳性患者中与低的血清DNA载量和异常ALT水平相关，但在HBeAg阴性患者中无相关。HBeAg阴性患者BCP/PC区平均核苷酸突变数量显著高于HBeAg阳性患者，BCP/PC区突变核苷酸数量与HBeAg阴性样本比率呈正相关（儿童患者R2=0.909,成人患者R2=0.962）。儿童患者BCP/PC区平均核苷酸突变数量显著低于成人患者，年龄越低的儿童，平均核苷酸突变数量也越低，随着患者年龄的增加及感染时间增长，核苷酸突变数量逐渐累积增加。核苷酸A1846T、G1896A、G1899A在HBeAg阴性儿童患者中的突变率显著低于HBeAg阴性成人患者（G1896A突变：41.1%比91.67%；A1846T突变：17.8%比37.5%；G1899A突变：7.8%比20.8%）。BCP/PC区核苷酸突变频率与基因型相关，C基因型患者BCP/前C区平均核苷酸突变数量显著高于B基因型患者。我们筛选到11个与基因型相关的突变位点，其中nt1721等10个位点的突变主要见于C基因型患者，而nt1752突变主要见于B基因型患者。ntG1721A、A1775G、C1856T和T1858C突变主要以联合突变的模式出现。联合突变类型G1721A/A1775G/T1858C仅出现在C基因型儿童患者中，并且与较低的患者年龄和较高的DNA滴度相关。3.C基因区突变情况：慢性HBV感染儿童C基因区氨基酸突变率及平均氨基酸突变数均远低于成人患者。C基因区氨基酸热点突变类型主要有P5T、V13A、L60V、S87G、I97L、P130T、P135Q等，这些突变位点主要位于B细胞表位（Core74-89、Core130-138）和Th表位（Core1-20、Core50-69），CTL表位突变较少。C基因区氨基酸的突变与HBeAg阴性状态显著相关，Y38H、S49T、E77D、S87G、I97L、E113、P135Q、R151Q等八种突变类型在HBeAg阴性儿童及成人患者中的突变率均明显高于HBeAg阳性患者。在HBeAg阳性儿童患者中，发生氨基酸突变的患者ALT水平更高、DNA滴度更低，但在HBeAg阴性儿童患者中则无相关性。儿童患者C基因区核苷酸突变以同义替换为主，本次分析未检出正选择位点；而成人患者同义替换与错义替换相近，检出P5、V13、S87、I97和L130五个正选择位点。C基因区正选择位点更多见于HBeAg阴性患者，我们在HBeAg阳性成人患者中未检测到正选择位点，但在HBeAg阴性成人患者中检测到九个正选择位点（包括：P5、V13、G74、A84、S87、I97、L130、P135、R151），其中88.9%（8/9）的正选择位点位于免疫表位区，以B细胞表位和Th表位为主。4.S区突变情况：疫苗接种免疫保护失败儿童a决定簇氨基酸突变率32.9%，高于未接种疫苗患儿（10%）和成人患者（22.9%）。疫苗接种儿童MHR区氨基酸突变率50.6%，也高于未接种疫苗儿童（30%）和成人患者（39%）。在MHR和a决定簇突变率较高的热点突变类型主要有I110L、K122R、T126A、I126T、P127T、Q129R/H、M133L及G145R等。Q129R、D144A、G145R和N146D仅在疫苗接种组儿童中被检出，可能与疫苗逃逸相关。疫苗接种儿童免疫表位区发生的突变，主要位于B细胞表位（占52.8%），而成人患者主要位于CTL表位（占64.6%），未接种疫苗儿童散在分布于S区。在CTL和Th表位区，aa21、aa40、aa44、aa210在成人患者中突变率较高，在疫苗接种儿童中突变率较低，而在未接种儿童中未见检出，提示这四个位点的突变可能与免疫逃逸相关。突变率最高的CTL和Th表位分别为S207-216、S37-51，这两个表位可能是S抗原承受免疫选择压力的主要区域。S区氨基酸突变与基因型相关。C基因型患者S区氨基酸突变发生率、平均氨基酸突变数均显著高于B基因型患者。该差异主要存在于CTL表位区，而在Th表位、B细胞表位/MHR及a决定簇则无明显差异。aa3、aa53、aa68、aa194及aa210五个位点在C基因型儿童及成人患者中的突变率显著高于B基因型患者（P<0.001）。S区氨基酸突变与HBeAg状态相关。HBeAg阴性患者S区氨基酸突变率及平均氨基酸突变数均显著高于HBeAg阳性患者。在Th表位该差异最显著，在CTL表位也有显著性差异，但在B细胞表位/MHR及a决定簇，差异无显著性意义。位于Th表位和/或CTL表位的L21S、N40S、G44E突变与HBeAg状态最相关，在HBeAg阴性患者中的突变率明显高于HBeAg阳性患者。疫苗接种儿童MHR及a决定簇突变与低的DNA滴度及异常ALT水平相关，与年龄、性别、HBeAg状态及基因型无相关。成人患者MHR及a决定簇突变与上述临床资料间均无相关。在疫苗接种儿童患者中，B细胞表位突变与低的DNA滴度相关(P<0.001)，CTL表位突变与DNA滴度不相关；但在成人患者则刚好相反，CTL表位突变与低的DNA滴度相关(P<0.001)，B细胞表位突变与DNA滴度不相关。HBeAg阴性患者S区核苷酸突变以非同义替换为主，而在HBeAg阳性患者以同义替换为主，HBeAg阴性患者受到的选择压力更强。B基因型患者S区核苷酸突变以非同义替换为主，C基因型患者以同义替换为主，B基因型患者受到更强的选择压力，且随着年龄的逐渐增加，B基因型患者进化速度更快。在S区，未接种疫苗儿童受选择压力较低，未筛选到有显著性意义的正选择位点，氨基酸突变多为自然筛选。疫苗接种儿童受到较弱的选择压力，S区检出5个正选择位点，这些位点主要位于a决定簇及非免疫表位区，突变主要与疫苗逃逸相关。成人患者受到较强的选择压力，S区检出12个正选择位点，这些位点主要位于免疫表位区，氨基酸突变主要与免疫逃逸相关。
【作者】黄勇；
【导师】黄爱龙；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】乙型肝炎病毒；BCP/PC区突变；C基因区突变；S区突变；儿童；

【参考文献】
[1]朱康.基于多尺度几何变换的遥感图像融合方法研究[D].湖南师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[2]施鹏.流程工业生产过程柔性报表系统关键技术的研究[D].北京化工大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[3]赵亚敏.缝隙电磁散射的算法研究[D].西北工业大学,电磁场与微波技术,2004,硕士.
[4]霍纯青.特种环氧树脂的合成与改性研究[D].长春工业大学,化学工程,2013,硕士.
[5]贾苹.多元文化背景下我国当代大学生信仰教育研究[D].首都师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[6]熊建新.地理研究性学习的理论与实践[D].湖南师范大学,2004.
[7]刘进.水上开放性博物馆的构建[D].西安美术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[8]阮氏秋红.越南学生汉语常用动量词习得与偏误分析[D].广西民族大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[9]文青波.低温SCR脱硝催化剂的制备及其数值模拟[D].湖南大学,环境科学与工程,2012,硕士.
[10]詹文法.验证平台的可重用性研究[D].合肥工业大学,检测技术与自动化装置,2004,硕士.
[11]郝晓红.杜威自然审美观研究[D].湖南师范大学,美学,2014,硕士.
[12]杨桄.基于多特征空间的遥感专题信息自动提取方法研究[D].东北师范大学,2003.
[13]龚玄辉.传感器网络MAC地址复用压缩算法研究与仿真实现[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[14]凌宏惠.宋代筆記語音資料研究[D].湖南师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[15]柴新.367例早期乳腺癌保乳治疗的中长期预后回顾性分析[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[16]詹米璐张琴.九龙坡:全力推动高新区“三次创业”提速提质[N].重庆日报,2015-01-12006.
[17]郝建勋.人参产品的质量评价及其影响因素[D].吉林农业大学,生药学,2012,硕士.
[18]朱慧云.数据挖掘在电子商务中的应用研究[D].河海大学,2003.
[19]时庆洁.人民网国际新闻报道研究[D].河北大学,新闻学,2014,硕士.
[20]孙智伟,白俊强,高正红,肖春生,郝礼书.现代超临界翼型设计及风洞试验研究[J].航空学报.
[21]严芬.分布式多层应用系统及其安全控制的研究与应用[D].扬州大学,2002.
[22]王剑.我国战略性新兴产业的融资模式研究[D].苏州大学,金融学,2013,博士.
[23]何乐飞.基于020的团购网站商业模式研究[D].浙江工业大学,2012.
[24]薛利红,曹卫星,罗卫红,张宪.小麦叶片氮素状况与光谱特性的相关性研究[J].植物生态学报,2004,02:172-177.
[25]宋娟,顾斌,李鑫,王银珠,张莉莉,程志鹏,姚成,仲慧.纳米材料应用于氧化还原蛋白质直接电化学的研究进展[J].材料导报,2012,S1:14-18+26.
[26]李引引.《日瓦戈医生》中的命运主题[D].黑龙江大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[27]蒋丹凤.服务贸易对我国经济增长贡献的分析[D].西南交通大学,世界经济,2013,硕士.
[28]黄昭静.我国突发公共事件中的政府信息公开制度研究[D].湖北大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[29]房晓菲.无线传感器网络节能路由算法研究[D].浙江工业大学,2008.
[30]李祥.中药复方三妙丸的物质基础和药代动力学研究[D].第二军医大学,药物分析学,2013,硕士.
[31]郭舞阳.城市商业银行员工绩效管理研究[D].河北大学,会计,2014,硕士.
[32]齐郑,董迪,杨以涵.中性点不接地系统铁磁谐振与单相接地辨识技术[J].电力系统自动化,2010,01:55-58+83.
[33]张喜娜.扶正颗粒对免疫低下模型大鼠动脉血淋巴细胞亚群影响的研究[D].浙江中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[34]孙以栋,应华东.高等院校基于工作室制的艺术设计人才培养模式探索与实践[J].包装世界,2014,01:54-55.
[35]余霞.晚唐五代贾岛接受史研究[D].陕西师范大学,中国古代文学,2004,硕士.
[36]钟苏宁.锦屏山地下暗物质实验室中氡本底的模拟研究[D].辽宁大学,理论物理,2012,硕士.
[37]王健.路企信息共享系统项目管理中的风险评价[D].西南交通大学,项目管理,2013,硕士.
[38]魏毅龙.煤矿井下探测与搜救机器人机械系统设计与研究[D].中国矿业大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[39]张维.保定市供水总公司发展战略研究[D].河北大学,工商管理,2014,硕士.
[40]王乐.CEO声誉定量评价研究[D].浙江大学,2004.
[41]韦令华.不同情绪条件下认知重评策略对认知加工的影响：一项ERP研究[D].广西师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[42]魏通先.农业展览面面观[J].装饰.1996(03)
[43]薛飞.人际关系理论视角下高校管理决策有效性研究[D].鲁东大学,教育学原理,2013,硕士.
[44]李晓娇.西替利嗪在介孔分子筛中的组装及释放研究[D].吉林大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[45]王秉湖.零售业中的ECR和POS产品应用及其选型(4)[J].信息与电脑.1994(06)
[46]甘雨.五个民族自治区农村居民消费需求实证研究[D].中南民族大学,中国少数民族经济,2013,硕士.
[47]彭帆.我国中小商业银行流动性风险研究[D].苏州大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[48]徐燕.c-Jun在三苯氧胺抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖中的作用初探[D].苏州大学,普通外科学,2013,硕士.
[49]吴磊.运用土地政策参与国家宏观调控研究[D].东北大学,政治经济学,2009,硕士.
[50]宋宁.长距离重力流输水系统有无支管水锤防护方法分析[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.