精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1对小鼠结肠癌CT26细胞凋亡影响及其机制研究

【摘要】研究背景及目的：结肠癌是世界范围内最常见及对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，具有很高的发病率和死亡率。肿瘤细胞的凋亡是其重要生物学行为。肿瘤无限制地生长、对各种抗肿瘤治疗耐受，与基因调控失常引起的凋亡异常有密切关系。精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1是一种重要的单ADP核糖基转移酶。被认为可能与多种细胞生物学行为存在密切的关系，但ART1与疾病的关系研究甚少。本课题组前期对ART1与结肠癌的生物学行为的关系做了一定的研究，发现ART1基因沉默与小鼠结肠癌CT26细胞的增殖、侵袭转移、分化、微血管形成均有一定的关系。然而ART1对结肠癌细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。本课题拟在前期工作基础上，以ART1-shRNA和ART1-cDNA慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞，分别介导ART1基因沉默或高表达，以顺铂（CDDP）作为凋亡诱导剂，探讨ART1表达水平改变对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的影响，并进一步探讨ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的相关分子机制，为ART1作为结肠癌抗肿瘤治疗的新靶点提供实验依据和理论支持。方法：本研究分为两部分进行。1、ART1对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡影响的研究（1）ART1沉默及ART1高表达慢病毒载体稳定转染CT26细胞株获取和鉴定以慢病毒介导的ART1-shRNA和ART1-cDNA分别转染小鼠结肠癌CT26细胞，同时设立空载体病毒转染对照组（LV-control组）和未转染对照组（Untransfected组）。1）荧光显微镜下观察GFP绿色荧光表达强度，对转染效果进行鉴定。2）RT-PCR方法检测各组转染CT26细胞ART1mRNA表达，从mRNA水平进行鉴定。3）WesternBlot方法检测各组转染CT26细胞ART1蛋白表达，从蛋白水平进行鉴定。（2）ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的离体研究1）以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。DNALaddering观察各组CT26细胞凋亡梯状条带(Ladder)形成情况。2）以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。分别以AnnexinV-PE/7-AAD流式细胞检测和Hoechst33342凋亡细胞计数观察ART1对CDDP诱导后CT26细胞凋亡水平的影响。3）以CDDP处理后的LV-control组和Untransfected组CT26细胞为对照，ART1-shRNA组CT26细胞、ART1-cDNA组CT26细胞为实验组，CCK8细胞计数方法检测ART1对CDDP诱导后CT26细胞生存率的影响。（3）ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的在体研究1）建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡，腹腔注射等体积生理盐水为对照。观察各组CT26细胞皮下移植瘤体积和重量变化，探讨ART1对CT26细胞皮下移植瘤生长的影响。2）建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡，腹腔注射等体积生理盐水为对照。WesternBlot法检测各组移植瘤细胞PARP-1裂解水平，探讨ART1对移植瘤细胞凋亡水平的影响。2、ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡机制的研究（1）Akt、ERK细胞信号通路及NF-κB的检测1）Akt表达和活性的检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞Akt的表达和phos-AktT308的表达。2）PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞ART1、Akt表达及Akt磷酸化水平影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组，经LY294002处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot法检测各组CT26细胞ART1、Akt和phos-AktT308的表达。3）ERK表达和活性的检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞ERK和phos-ERK的表达。4）MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞ART1、ERK表达及ERK磷酸化水平影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组，经PD98059处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot检测CT26细胞ART1、ERK和phos-ERK的表达。5）核转录因子NF-κBp65表达和核转位水平的检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法分别检测各组CT26细胞全细胞核转录因子NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。6）PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞NF-κBp65表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组，经LY294002处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot检测CT26细胞全细胞NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。7）MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞NF-κBp65表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组，经PD98059处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot检测CT26细胞全细胞NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。（2）Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达检测1）Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。2）PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组，经LY294002处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot检测CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。3）MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组，经PD98059处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot法检测各组小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。（3）微管蛋白TUBB3表达的检测1）CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞TUBB3蛋白的表达；同时，建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡，腹腔注射等体积生理盐水为对照。WesternBlot方法检测各组移植瘤细胞TUBB3蛋白的表达。2）CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3mRNA表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂，分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。RT-PCR法检测各组细胞TUBB3mRNA的表达。同时，建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡，腹腔注射等体积生理盐水为对照。RT-PCR法检测各组移植瘤细胞TUBB3mRNA的表达。3）PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组，经LY294002处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot检测各组CT26细胞TUBB3的表达。4）MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组，经PD98059处理的CT26细胞为实验组，以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡，WesternBlot法检测各组CT26细胞TUBB3的表达。结果：1、ART1对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的影响（1）ART1基因沉默及高表达慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞获取及鉴定荧光显微镜下观察结果显示，ART1-shRNA、ART1-cDNA或空载体慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞后，均见荧光，具有荧光的细胞达70%-80%；RT-PCR结果显示，ART1-shRNA慢病毒转染CT26细胞后ART1mRNA表达较对照组显著降低（P<0.05），ART1-cDNA慢病毒转染CT26细胞后，ART1mRNA表达较对照组明显增高（P<0.05），LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较ART1mRNA表达无明显改变（P>0.05）。WesternBlot结果显示，ART1-shRNA慢病毒转染CT26细胞后ART1蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05），ART1-cDNA慢病毒转染CT26细胞后，ART1蛋白表达较对照组明显增高（P<0.05），LV-control慢病毒转染CT26细胞与UntransfectedCT26细胞比较，ART1蛋白表达无明显改变（P>0.05）。证实成功获得ART1沉默及ART1高表达小鼠结肠癌CT26细胞株，慢病毒载体对CT26细胞ART1表达无影响。（2）ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的离体研究1）DNALaddering检测结果显示经CDDP处理后的ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control及Untransfected组CT26细胞均可见梯状条带，CDDP未处理的各组则无梯状条带。2）AnnexinV-PE/7-AAD流式检测结果显示，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞凋亡率显著上升（P<0.05），ART1-cDNA组CT26细胞凋亡率则显著下降（P<0.05），而LV-control组CT26细胞凋亡率与Untransfected组比较无明显变化（P>0.05）；未经CDDP处理的各组CT26细胞凋亡率很低，差别无统计学意义（P>0.05）。3）Hoechst33342凋亡细胞计数结果显示，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞凋亡率显著升高（P<0.05），ART1-cDNA组CT26细胞则凋亡率显著降低（P<0.05），而LV-control组CT26细胞凋亡率与Untransfected组比较，无明显变化（P>0.05）。未经CDDP处理的各组CT26细胞具凋亡特征的细胞极少，且差别无统计学意义（P>0.05）。4）CCK8检测结果显示，与LV-control组和Untransfected组CT26细胞CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞生存率明显下降（P<0.05），ART1-cDNA组CT26细胞生存率明显上升（P<0.05），LV-control组CT26细胞生存率与Untransfected组CT26细胞比较无明显变化（P>0.05）；（3）ART1对CDDP诱导的CT26细胞移凋亡影响的在体研究1）在Balb/c小鼠移植瘤中，与LV-control、UntransfectedCT26细胞移植瘤比较，ART1-shRNACT26细胞移植瘤体积和重量均明显降低（P<0.05），ART1-cDNACT26细胞移植瘤体积和重量均增加（P<0.05），LV-controlCT26细胞移植瘤与UntransfectedCT26细胞移植瘤比较差异无显著性（P>0.05）；2）WesternBlot对PARP-1裂解片段的检测显示，与LV-control、UntransfectedCT26细胞移植瘤比较，ART1-shRNACT26细胞移植瘤细胞凋亡率明显上升（P<0.05），而ART1-cDNACT26细胞移植瘤细胞凋亡率则下降（P<0.05），LV-controlCT26细胞移植瘤凋亡率与UntransfectedCT26细胞移植瘤比较差异无显著性（P>0.05）。2、ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡机制的研究（1）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞Akt、ERK表达和活性的影响1）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞Akt表达无明显改变（P>0.05）；LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较Akt表达变化无明显差异（P>0.05）；与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞phos-AktT308表达均明显下降（P<0.05），而ART1-cDNA组CT26细胞phos-AktT308表达均上升（P<0.05）；LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较phos-AktT308表达变化无明显差异（P>0.05）。2）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较，以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞ART1、Akt表达无明显改变（P>0.05），phos-AktT308表达明显下降（P<0.05）。3）WesternBlot结果显示与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，无论有无CDDP处理，ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞ERK蛋白表达无明显改变（P>0.05）；LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较ERK表达改变无明显差异（P>0.05）。无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞phos-ERK表达降低（P<0.05），ART1-cDNA组CT26细胞phos-ERK表达增高（P<0.05），LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较phos-ERK表达改变无明显差异（P>0.05）。4）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较，以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞ART1、ERK表达无明显改变（P>0.05），phos-ERK表达明显下降（P<0.05）。5）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变（P>0.05）；LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较全细胞NF-κBp65表达改变无明显差异（P>0.05）；与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞核内NF-κBp65表达明显下降（P<0.05）；ART1-cDNA组CT26细胞核内NF-κBp65表达明显上升（P<0.05）。LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较细胞核内NF-κBp65表达改变无明显差异（P>0.05）。6）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较，以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变（P>0.05），细胞核内NF-κBp65表达下降（P<0.05）。7）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较，以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变（P>0.05），细胞核内NF-κBp65表达亦无明显改变（P>0.05）。（2）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax表达的影响1）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达下降，Bax表达上升（P<0.05），Bcl-2/Bax比值降低；ART1-cDNA组CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达上升，Bax表达下降（P<0.05），Bcl-2/Bax比值增高；而LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达均无明显改变（P>0.05）。2）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较，以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达明显下降（P<0.05），Bax表达明显增高（P<0.05）。3）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较，以PD98059特异性抑制ERK通路活性后CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax表达均无明显改变（P>0.05）。（3）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞微管蛋白TUBBB3表达的影响1）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞TUBB3蛋白表达均下降（P<0.05）；ART1-cDNA组CT26细胞TUBB3蛋白表达均上升（P<0.05）。而LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较TUBB3蛋白表达无明显改变（P>0.05）；无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞移植瘤比较，ART1-shRNA组CT26细胞移植瘤细胞TUBB3蛋白表达均下降（P<0.05）；ART1-cDNA组CT26细胞移植瘤细胞TUBB3蛋白表达均上升（P<0.05）。而LV-control组CT26细胞移植瘤与Untransfected组CT26细胞移植瘤比较TUBB3蛋白表达无明显改变（P>0.05）；2）PT-PCR结果显示，无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较，ART1-shRNA组CT26细胞TUBB3mRNA表达均明显下降（P<0.05），在ART1-cDNA组CT26细胞TUBB3mRNA则表达上升（P<0.05），LV-control组CT26细胞TUBB3mRNA表达与对照组比较无明显改变（P>0.05）；无论有无CDDP处理，与LV-control组、Untransfected组CT26细胞移植瘤比较，ART1-shRNA移植瘤细胞TUBB3mRNA表达明显下降（P<0.05），ART1-cDNA移植瘤细胞TUBB3mRNA表达上升（P<0.05）。LV-control移植瘤细胞TUBB3mRNA表达与Untransfected组比较无明显改变（P>0.05）。3）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较，以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞TUBB3的表达明显下降（P<0.05）。4）WesternBlot结果显示，无论有无CDDP处理，与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较，以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞TUBB3的表达明显下降（P<0.05）。结论：1、ART1沉默显著提高CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞及Balb/c小鼠右腋窝CT26细胞皮下移植瘤细胞的凋亡水平，降低小鼠结肠癌CT26细胞生存率，抑制Balb/c小鼠右腋窝CT26细胞皮下移植瘤生长；ART1高表达则作用相反。ART1在离体或在体情况下均对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞的凋亡具有明确影响。2、ART1沉默CT26细胞Akt活化程度下降，NF-κBp65核转位水平下降，Bcl-2、Bcl-xl表达下降，Bax表达上升，ART1高表达作用相反；特异性抑制Akt通路时NF-κBp65核转位水平下降，Bcl-2、Bcl-xl表达下降，Bax表达上升，提示ART1可通过Akt/NF-κBp65/Bcl-2、Bcl-xl、Bax途径调节CDDP诱导后CT26细胞凋亡。同时，ART1沉默CT26细胞Akt活化程度下降，可使TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降，ART1高表达作用相反，特异性抑制Akt通路时TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降，提示Akt也可通过调节TUBB3参与ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡的调节。ART1沉默CT26细胞ERK活化程度下降，NF-κBp65核转位水平下降，Bcl-2、Bcl-xl表达下降，Bax表达上升，ART1高表达作用相反，但特异性抑制ERK通路时NF-κBp65核转位水平、Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达均无显著改变，提示ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡调节也与ERK有关，ART1可通过活化ERK，调节CDDP诱导的CT26细胞凋亡，这一调节作用与NF-κBp65/Bcl-2/Bcl-xl无明显关系。此外，ART1沉默CT26细胞ERK活化程度下降，TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降，ART1高表达作用相反，特异性抑制ERK通路同样使TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降，提示ERK可通过调节TUBB3对CDDP诱导的CT26细胞凋亡发挥调节作用。ART1有可能成为潜在的协同增效的抗肿瘤治疗靶点。
【作者】肖明；
【导师】王娅兰；
【作者基本信息】重庆医科大学，组织工程与细胞工程，2014，博士
【关键词】ART1；Apoptosis；Akt；ERK；Bcl-2；TUBB3；

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