肿瘤相关巨噬细胞过表达COX-2对乳腺癌恶性进程的影响及分子机制研究

【摘要】第一部分乳腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞COX-2的表达及临床意义目的：通过乳腺组织芯片，检测乳腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)内环氧化酶2(COX-2)蛋白表达水平，并分析其与乳腺癌临床数据之间的相关性。方法：本实验采用免疫组织荧光双染法，检测乳腺癌组织芯片（含160例乳腺癌组织及10例癌旁乳腺组织）中的TAM（CD163标记）、以及TAM中COX-2的表达情况。并用皮尔森相关系数分析COX-2+TAM与Ki67在临床标本中表达的相关性,Kaplan-Meier生存分析用于评价COX-2+TAM对总体生存率的影响；多变量Cox回归模型用于分析上述预后影响因素的风险比和独立性。结果：乳腺癌组织中COX-2+TAM单位面积平均光密度值为13.59±10.51mm-2，而其在癌旁组织中为1.56±1.27mm-2，两者比较差异有统计学意义(t=13.02，p＜0.001)；COX-2+TAM高表达组（大于平均光密度值）在临床分期Ⅲ期、组织学Ⅱ-Ⅲ级、淋巴结转移以及Ki67阳性表达中的数量明显高于COX-2+TAMs低表达组(p值分别为<0.001，0.024，0.021，0.03)，而两组在患者年龄、肿瘤大小以及乳腺癌分子分型中的数量无显著性差异(p>0.05)；此外，COX-2+TAMs与Ki67表达呈正相关性(r=0.449，p＜0.001)；COX-2+TAM的高表达可显著降低患者10年总体生存率（p=0.002），对5年总体生存率无明显影响（p=0.099），Cox多元回归分析显示其可作为乳腺癌独立预测因子之一（HR=2.085,p=0.036）。结论：临床相关性分析提示，TAM中过表达COX-2与乳腺癌的恶性进程密切相关，可作为乳腺癌不良预后的独立预测指标。第二部分肿瘤相关巨噬细胞过表达COX-2对乳腺癌增殖及侵袭能力的影响目的：探讨TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法：体外刺激人单核细胞株THP-1细胞贴壁成为巨噬细胞，并诱导其成为TAM。利用腺病毒载体系统上调或下调TAM中COX-2基因的表达。将单独培养、与过表达或靶向沉默COX-2基因的TAM共培养后的MDA-MB-231及MCF-7细胞进行平板克隆形成和CCK-8实验以测定各组增殖情况；细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭装置测定乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的改变。体内实验部分采用不同处理的人乳腺癌细胞株MCF-7对BABL/c雌性裸鼠进行异种移植,观测各组移植瘤瘤重的情况。结果：与TAM共培养组的MDA-MB-231及MCF-7细胞增殖率、迁移率和侵袭率较单独培养组明显增加，过表达COX-2的TAM对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力较前两组进一步提升，差异有统计学意义。下调TAM中COX-2基因的表达后，能明显抑制TAM对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。体内实验中，异种移植瘤的重量在单独培养组、TAM共培养组、TAM过表达COX-2组依次增加；TAM中COX-2基因表达下调后，异种移植瘤重量较TAM共培养组明显降低，差异有统计学意义。结论：TAM过表达COX-2能增强乳腺癌细胞的生长增殖、迁移侵袭能力。第三部分TAM过表达COX-2介导乳腺癌增殖及侵袭转移的分子机制研究目的：探讨和分析相关信号通路对TAM过表达COX-2介导乳腺癌增殖转移中的作用及分子机制。方法：Western-blot分析PI3K/Akt及ERK信号通路在不同条件下乳腺癌细胞中的表达激活情况；免疫组化分析p-Akt、p-ERK在异种移植瘤组织中表达及分布情况；使用PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin抑制PI3K/Akt通路，Ras-MAPK通路抑制剂U0126抑制ERK表达后进行CCK-8法测定各组细胞增殖情况，Transwell小室转移侵袭实验测定细胞侵袭能力。结果：westernblot结果显示，与单独培养组相比，与TAM共培养的乳腺癌细胞中p-Akt及p-ERK表达明显增加，TAM过表达COX-2可较前两组进一步增强两条信号通路的激活,而下调TAM中COX-2基因表达则会明显逆转此现象（p<0.01）；相同的结果也在乳腺癌裸鼠模型中获得，在TAM过表达COX-2的异种移植瘤组织中，p-AKt及p-ERK的阳性染色率高于TAM共培养组和单独培养组，下调TAM中COX-2基因表达，p-AKt及p-ERK的阳性染色率明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）。加入PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin或Ras-MAPK通路抑制剂U0126可分别抑制TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞PI3K/Akt及ERK通路的激活，同时逆转TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的促进作用。结论：TAM可通过过表达COX-2，进而激活乳腺癌细胞中PI3K/Akt以及ERK通路，发挥促肿瘤增殖及侵袭能力的作用。
【作者】杨冰；
【导师】任国胜；
【作者基本信息】重庆医科大学，护理学，2014，博士
【关键词】乳腺癌；肿瘤相关巨噬细胞；环氧化酶；免疫组织化学；增殖；侵袭；磷脂酰肌醇；3-激酶；细胞外信号调节激酶；

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