Mfn2在PCOS大鼠卵巢的表达及其对大鼠卵泡发育的影响与机制的初步探讨

【摘要】多囊卵巢综合征（polycysticovariansyndrome,PCOS）是临床最常见的妇科内分泌疾病，亦是引起育龄期妇女不孕的最常见原因，以长期无排卵、高雄激素血症及超声下双侧卵巢多囊样变为主要特征。近年来，PCOS被定义为一种代谢综合征，因其常伴有代谢障碍如肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症，且远期有发生2型糖尿病、高血压及其他心血管疾病的风险，严重影响生育年龄妇女的身心健康。至今PCOS的病因及发病机制尚未清楚。目前的研究主要集中在遗传相关基因、环境因素及卵巢局部分子生物学改变等方面。卵泡发育异常是PCOS主要的病理生理特征。研究显示卵泡发育障碍可能是PCOS患者持续不排卵和临床内分泌改变的病理基础。而卵泡的异常发育可能与颗粒细胞的凋亡相关，但具体机制尚未探明。线粒体融合素基因2（mitofusin2,Mfn2），是嵌于线粒体外膜的一种跨膜GTP酶，介导线粒体融合，参与调节线粒体的形态。人体Mfn2基因缺陷或突变可致2A型腓骨肌萎缩症等神经退行性疾病的发生。近年来越来越多的研究显示Mfn2除促进线粒体融合外，还参与多种代谢综合征如糖尿病、胰岛素抵抗及肥胖的发生及细胞凋亡的调节。研究显示小鼠Mfn1/Mfn2的缺失可致胚胎于孕中期死亡，提示Mfn2可能参与胚胎的发育。然而目前尚无Mfn2参与卵巢功能调节的研究。为明确ratmitofusin2(rMfn2)在大鼠卵泡发育中的作用，探讨其是否参与PCOS的发病，我们设计此实验。第一部分：rMfn2在正常大鼠及PCOS大鼠卵巢组织的表达目的：探讨rMfn2在正常大鼠及PCOS模型大鼠卵巢组织的表达差异，明确rMfn2是否参与PCOS的发病。方法：选取6周龄SD雌性大鼠来曲唑灌胃建立PCOS模型，观察大鼠体重及卵巢体重变化，HE染色评估卵巢形态，放射免疫法检测血清E2、T、P、FSH及LH水平。免疫组织化学法分析rMfn2、Bcl-2及Bax在大鼠卵巢的定位表达。RT-PCR和Westernblotting分别从mRNA和蛋白质水平定量分析卵巢组织rMfn2的表达。结果：与对照组比较，PCOS模型组大鼠体重增长明显低于对照组，卵巢重量明显高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）；模型组血清LH、T浓度较对照组明显增高，E2、P浓度明显降低，差异有统计学意义（p<0.05）；两组血清FSH浓度无统计学差异（p>0.05）；HE染色显示对照组大鼠卵巢镜下可见多个新鲜黄体和不同生长阶段的各级卵泡；模型组大鼠卵巢镜下见典型多囊改变，可见较多小卵泡及囊状扩张的大卵泡，卵泡内层颗粒细胞层数明显减少，未见黄体；免疫组织化学检测显示rMfn2广泛表达于两组大鼠颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵泡液、黄体及卵巢间质；rMfn2在PCOS大鼠颗粒细胞上的表达明显弱于对照组，同时Bcl-2在PCOS大鼠颗粒细胞的表达也较对照组降低，而Bax的表达较对照组增强，差异有统计学意义（p<0.05）；RT-PCR和Westernblotting结果显示PCOS模型组大鼠卵巢组织rMfn2mRNA及蛋白表达均明显低于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。结论：来曲唑成功诱导PCOS大鼠模型；PCOS大鼠颗粒细胞凋亡可能增加；rMfn2广泛表达于大鼠颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵泡液、黄体及卵巢间质，PCOS大鼠颗粒细胞rMfn2的表达下调可能参与PCOS的发生。第二部分：Lenti-GFP-rMfn2过表达载体的构建及鉴定目的：构建并鉴定rMfn2过表达的慢病毒载体（lenti-GFP-rMfn2）。方法：pLenO-GTP载体酶切线性化，与PCR扩增的rMfn2基因连接、转化，提取重组质粒，通过酶切法和DNA测序对重组质粒进行鉴定。将鉴定正确的重组质粒转染293T细胞，收集提纯病毒，同时采用流式细胞仪检测活细胞比率测定病毒滴度。结果：重组质粒经酶切和DNA测序鉴定正确。重组质粒转染293T细胞可见绿色荧光表达，提示质粒重组成功。病毒滴度测定滴度为2.2×108TU/ml。结论：Lenti-GFP-rMfn2过表达载体构建成功。第三部分：rMfn2对大鼠颗粒细胞的作用及信号通路的初步研究目的：探讨rMfn2对正常大鼠卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及相关信号通路。方法：体外大鼠原代颗粒细胞的培养及鉴定。细胞免疫荧光检测rMfn在颗粒细胞的定位表达。Lenti-GFP-rMfn2体外转染大鼠颗粒细胞，Westernblotting鉴定转染结果。转染成功后MTT法绘制颗粒细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率，Westernblotting检测rMfn2及相关信号通路蛋白Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt的表达。结果：细胞免疫荧光显示rMfn表达于正常大鼠颗粒细胞胞浆。Westernblotting检测显示Lenti-GFP-rMfn2成功转染大鼠颗粒细胞，MTT检测显示rMfn2过表达组（MFN组）细胞的增殖速率明显高于其余两组细胞（正常对照CON组和空病毒GFP组），差异有统计学意义（p<0.05）；细胞周期检测显示MFN组细胞在G1期所占比例明显下降，S及G2期所占比例明显增加，差异有统计学意义（p>0.05）。凋亡率检测显示CON组、GFP组及MFN组三组细胞凋亡率均很低，三组间差异无统计学意义（p>0.05）。Westernblotting检测显示MFN组颗粒细胞Bcl-2的表达明显增加，Bax的表达减少，差异有统计学意义（p<0.05）；MFN组p-Akt蛋白的表达增加，差异有统计学意义（p<0.05），Akt在三组间表达无统计学差异（p>0.05）。结论：rMfn2过表达促进正常大鼠颗粒细胞的增殖，其机制是激活PI3K/Akt信号通路，引起下游Bcl-2表达增加，Bad及Bax表达减少，从而促进颗粒细胞增殖。第四部分：rMfn2对正常大鼠及PCOS大鼠卵泡发育的影响研究目的：观察rMfn2对正常大鼠及PCOS大鼠卵泡发育的影响。方法：60只2月龄SD雌性大鼠随机分成以下四组：对照组（CON组，仅注射生理盐水），空病毒组（GFP组，注射Lenti-GFP慢病毒颗粒），目的病毒组（MFN组，注射Lenti-GFP-rMfn2慢病毒颗粒），目的病毒+来曲唑组（ML组，在Lenti-GFP-rMfn2慢病毒颗粒注射30天后开始来曲唑灌胃连续23天），来曲唑组（LT组，采用第一部分PCOS模型标本）。荧光显微镜观察卵巢组织及全身其他组织rMfn2的表达；realtimeRT-PCR和Westernblotting定量检测rMfn2及性激素相关受体（ER、PR、FSHR、LHR）的表达；HE染色评估卵巢形态，放射免疫法检测血清E2、T、P、FSH及LH水平。结果：慢病毒转染第30天，realtimeRT-PCR和Westernblotting检测结果显示MFN组大鼠卵巢rMfn2呈过表达状态；荧光显微镜及Westernblotting检测显示rMfn2过表达载体转染大鼠卵巢，其过表达存在时间依赖性，随着时间的延长表达逐渐增强，直至转染第60天仍持续稳定表达。Westernblotting检测显示转染第60天MFN组ER及PR在子宫的表达高于GFP组，差异有统计学意义（p<0.05）；FSHR及LHR的表达，GFP及MFN两组间比较无统计学差异（p>0.05）。HE染色显示转染第60天MFN组大鼠卵巢镜下见较多黄体，始基卵泡及多个发育良好的窦状卵泡；ML组大鼠卵巢镜下仍可见囊状扩张卵泡，但较LT组明显减少，同时可见黄体组织、始基卵泡、窦状卵泡甚至排卵前卵泡，且卵泡内卵母细胞存在。放射免疫检测显示MFN组大鼠血清E2、P水平明显高于CON组、ML组及LT组，T水平远低于CON组、ML组及LT组，差异有统计学意义（p<0.05）；ML组与LT组比较，血清FSH与T水平变化不大，E2、P水平明显增加，LH水平降低，差异有统计学意义（p<0.05）。结论：rMfn2过表达影响大鼠生殖内分泌功能，促进正常大鼠卵泡发育；rMfn2过表达可能抑制来曲唑诱导的大鼠卵巢多囊样变，具体机制有待进一步研究。
【作者】胡小靖；
【导师】姚珍薇；
【作者基本信息】重庆医科大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】多囊卵巢综合征（PCOS）；大鼠模型；来曲唑；ratmitofusin2(rMfn2)；慢病毒；过表达；颗粒细胞；增殖；Akt；卵泡发育；

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