从内质网应激调控探讨NGF-TrkA保护大鼠心脏缺血/再灌注损伤的作用及机制

【摘要】目的以在体大鼠心脏局部缺血再灌注模型为研究对象，探讨内源性NGF在心肌缺血和再灌注早期表达的特点；以离体大鼠心脏全心停灌复灌模型为研究对象，观测外源性NGF对IRI心脏功能恢复、心肌损伤程度、凋亡程度的影响，探讨其量效关系；以H9C2心肌细胞缺氧复氧模型为研究对象，观测培养液中加入外源性NGF对细胞凋亡、内质网应激相关通路蛋白的表达、心肌细胞内钙离子浓度的影响，阐明NGF-TrkA对心肌细胞缺氧后内质网应激和细胞凋亡的影响，探讨两者的相关性及调控机制。方法第一部分健康成年雄性SD大鼠24只，鼠龄8~10周，体重200~300g。将大鼠心脏随机分至四组（n=6）。假手术组（S组）：大鼠开胸后于LAD下用细线穿过但不结扎，持续180min；单纯缺血组（I组）：开胸后结扎LAD30min；缺血再灌注组（I/R组）：结扎LAD30min后复灌120min；K252a组：缺血前30min皮下注射K252a50μg/kg，缺血和复灌过程同I/R组。记录缺血前、缺血30min时及再灌注120min各组大鼠心率(Heartrate,HR),平均动脉压(Meanarterialpressure,MAP)。各组实验结束时颈总动脉取血，ELISA法测定血清LDH和CK-MB浓度。各组实验结束后取心尖组织，RT-PCR测定NGFmRNA，Western-blot测定NGF表达的水平。I/R组再灌注末取左心室前壁心肌组织（缺血区，IS区）和右室壁心肌组织（非缺血区，NIS区），免疫组化法测定NGF的表达。第二部分健康成年雄性SD大鼠48只，鼠龄8~10周，体重200~300g。将大鼠离体心脏随机分至6组（n=8）：假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ组、NGF+K252a组。Sham组K-H液持续灌注225min；I/R组K-H液平衡灌注75min，然后停灌30min，复灌120min；NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ组平衡灌注45min后，分别采用含NGF10、100、1000ng/ml的K-H液继续灌注30min，停灌30min，复灌120min；NGF+K252a组平衡灌注15min后，用含K252a100nM的K-H液灌注30min，再用含NGF100ng/ml的K-H液继续灌注30min，停灌30min，复灌120min。测定平衡灌注末期(BL)及再灌后5min、30min、60min、120min时各组心功能指标：心率（HR）、左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)。停灌前即刻和再灌注后5min收集冠脉流出液2ml，测定流出液中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK-MB）的浓度。各组实验结束取左心室前壁心肌组织石蜡切片，TUNEL染色后检测心肌凋亡。第三部分培养的H9C2心肌细胞，按照不同处理方式分组。空白对照组(C组):用正常培养液在通有95%空气+5%CO2的37℃培养箱内培养8h；缺氧复氧组（H/R组）:用预先经95%N2+5%CO2混合气饱和的无氧培养液在37℃无氧培养箱（95%N2+5%CO2）培养4h，再用含氧培养液在37℃正常培养箱（95%空气+5%CO2）复氧培养4h；NGFⅠ~Ⅲ组：分别在缺氧前4h，缺氧前即刻和复氧前即刻在相应的培养液中加入NGF，使NGF在培养液中的浓度达到100ng/ml;NGF1~4组：复氧培养液中加入NGF复氧4h，使NGF在培养液中的浓度分别达到1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml，其余处理同H/R组；NGF+K252a组，复氧培养液中加入NGF和K252a复氧4h，NGF和K252a在培养液中的浓度分别为100ng/ml和100nM，其余处理同H/R组；NGF+LY294002组，复氧培养液中加入NGF+LY294002复氧4h，NGF和LY294002在培养液中的浓度分别为100ng/ml和50μM，其余处理同H/R组；各组处理结束后CKK法测定细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western-blot测定GRP78,CHOP,caspase-12,p-Akt/Akt等蛋白表达水平，荧光染色后激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子荧光强度。结果第一部分（1）缺血30min后和再灌注120min后，I组、I/R组和K252a组HR与S组相比均明显增加（P<0.0001）；缺血30min时，I组、I/R组和K252a组MAP均低于S组（P<0.05），K252a组低于I组和I/R组（P<0.05）。再灌注120min时，K252a组MAP仍然低于I/R组和S组（P<0.05）。（2）与S组相比，I组、I/R组和K252a组处理结束时血清CK-MB和LDH浓度均明显升高（P<0.01），其中K252a组的心肌酶浓度明显高于其他两组（P<0.01），I/R组高于I组（P<0.01）。（3）在经过I/R处理的大鼠心脏上，IS区NGF的阳性表达率37%±4%，NIS区NGF表达率12%±3%，IS区明显高于NIS区（P<0.01）。（4）与S组相比，I组、I/R组、K252a组NGFmRNA和NGF蛋白的表达均明显增加（P<0.0001），其中I/R组和K252a组NGFmRNA的表达高于I组（P<0.0001），I/R组和K252a组之间差异无统计学意义（P>0.05）。第二部分（1）再灌注120min时，I/R组、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ组、NGF+K252a组HR，LVDP，±dp/dtmax均明显降低，NGFⅠ/Ⅱ组LVDP高于NGFⅢ组（P<0.01），NGFⅡ组±dp/dtmax明显高于NGFⅢ组（P<0.01），NGF+K252a组和I/R组之间差异无统计学意义（P>0.05）。再灌注120min时上述各组LVEDP均高于Sham组，NGFⅡ组LVEDP明显低于除Sham组外的其余各组（P<0.01）。（2）再灌注后，I/R组、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ组、NGF+K252a组两种LDH、CK-MB浓度和凋亡率均不同程度增加，高于Sham组（P<0.001）。在给予NGF的三组中，NGFⅡ组心肌酶浓度和凋亡率最低（P<0.01），NGFⅢ组细胞凋亡率最高（P<0.01）。第三部分（1）与H/R组比较，缺氧前4h（NGFⅠ组）、缺氧前即刻（NGFⅡ组）和复氧前即刻（NGFⅢ组）给予NGF均能提高H9C2心肌细胞缺氧复氧后的存活率（P<0.05），NGFⅢ组细胞存活率高于NGFⅠ组和Ⅱ组（P<0.05）；与H/R组比较，复氧液中10ng/ml和100ng/ml的NGF均可提高H9C2心肌细胞缺氧复氧后的存活率（P<0.05），其中100ng/ml的NGF心肌保护效果较明显（P<0.01）。（2）与对照组相比，经过缺氧4h、复氧4h处理的H9C2心肌细胞（H/R组）凋亡率明显升高（P<0.0001），NGF可明显减少细胞凋亡（vsH/R组,P<0.0001）。TrkA受体阻断剂K252a和PI3K抑制剂LY294002可完全阻断NGF抗心肌细胞凋亡的作用，细胞凋亡率与单纯缺氧复氧组差异无统计学意义（P>0.05）。（3）NGF可促进缺氧复氧后心肌细胞P-Akt的表达，NGF组p-Akt的表达水平明显高于其他组（P<0.0001）。同时使用TrkA受体阻断剂K252a或PI3K抑制剂LY294002时，p-Akt的表达水平明显下降，其中NGF+LY294002组表达水平最低（P<0.0001）。与Sham组比较，H/R组心肌细胞GRP78、CHOP、Caspase12的表达水平均明显升高（P<0.01）。给予NGF可减少上述蛋白的表达，同时给予K252a或LY294002时，上述蛋白的表达均再次增加，NGF+LY294002组GRP78，CHOP的表达高于H/R组（P<0.01）。（4）几种蛋白中，GRP78，CHOP，Caspase-12的蛋白表达与心肌细胞凋亡率呈正相关，r值分别为0.19，0.63，0.67，P<0.01或0.05；P-Akt表达与心肌细胞凋亡率呈负相关，r值为-0.45，P<0.05；（5）各组心肌细胞H/R后胞内钙离子荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）结论（1）心肌缺血后早期即可诱发NGF的高表达，并将这种高表达延续至再灌注过程。再灌注早期，NGF的表达在缺血区心肌细胞尤为明显，该现象可能是缺血心肌的一种内源性保护性反应（2）外源性NGF对缺血心脏具有非神经源性的抗细胞凋亡作用，且该作用存在剂量依赖性。适当剂量的外源性NGF预处理可减轻离体心脏缺血再灌注损伤，减少心肌细胞凋亡；当NGF剂量过高时心肌保护效应消失，甚至加重心肌损伤。（3）NGF可通过PI3K-Akt通路减少心肌缺氧所引起的心肌细胞凋亡，其机制与调控缺氧后内质网应激反应的程度有关。NGF对缺氧复氧后细胞内钙离子浓度无明显影响，其抗心肌凋亡的作用与调控胞内钙浓度无关。
【作者】魏珂；
【导师】闵苏；
【作者基本信息】重庆医科大学，麻醉学，2014，博士
【关键词】神经营养因子；缺血/再灌注；心脏；内质网应激；

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