基于内皮—间质转化的心肌纤维化细胞模型的建立和瓜蒌薤白白酒汤的应用

【摘要】目的：基于心肌纤维化过程的内皮-间质转化(EndMT),以冠状动脉内皮细胞为基础细胞,建立一种新的心肌纤维化细胞模型；并在此模型基础上,开展该模型的应用研究,观察瓜萎薤白白酒汤(GXD)对心肌纤维化的影响,明确瓜蒌薤白白酒汤对心肌纤维化的作用机理及作用靶点,为瓜萎薤白白酒汤临床用于心肌纤维化的治疗提供实验支持。方法：实验分为4个部分。1.基于EndMT;心肌纤维化细胞模型的构建：以人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)为基础细胞,rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3为候选诱导剂,以内皮细胞标志性蛋白CD31和间质细胞特异性蛋白FSP1/α-SMA为检测指标,从作用时间、剂量、作用强度筛选出合适的诱导剂,并通过检测心肌纤维化相关指标Ⅰ、Ⅲ型胶原含量、MMP-1、MMP-9进行模型的鉴定。2.心肌纤维化细胞模型的应用—瓜萎薤白白酒汤对心肌纤维化内皮-间质转化的影响：由于现在临床上没有良好的治疗心肌纤维化的药物,所以本课题选择具有一定研究基础的治疗“胸痹”的传统中药复方–瓜蒌薤白白酒汤为新构建的心肌纤维化细胞模型的应用药物。利用新构建的心肌纤维化细胞模型,以冠状动脉内皮细胞为基础细胞,加入诱导剂,复制心肌纤维化细胞模型,检测JCD31、FSP1和α-SMA,从细胞水平观察瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位对心肌纤维化内皮-间质转化的影响；复制细胞模型,检钡TGFβ通路Smad1、Smad2及其上游Notch通路Notch受Northl和Notch配体Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL2、DLL3,从分子水平观察瓜萎薤白白酒汤正丁醇部位对心肌纤维化内皮–间质转化的影响。3.瓜萎薤白白酒汤抑制心肌纤维化内皮-间质转化的整体验证：在整体实验上瓜萎薤白白酒汤是否也能抑制心肌纤维化的EndMT呢,如果体外–体内结果实现了一致性,说明应用我们构建的细胞模型得到的研究结果是可靠、可信的。采用结扎动物左冠状动脉前降支复制大鼠心肌纤维化模型,观察瓜萎薤白白酒汤对模型动物心脏指数、血流动力学、超声心动图参数、心肌酶谱、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量、心肌组织病理学检查、Masson染色检查心肌组织胶原容积分数(CVF)的影响；通过新构建的心肌纤维化细胞模型,我们发现瓜萎薤白白酒汤通过Notch通路抑制TGF-β通路而实现保护内皮细胞,阻断EndMT,抑制心肌纤维化。通过组织免疫组化、免疫荧光和Westernblot检测整体实验动物心肌纤维化组织TGF-β1、CD31、FSP1和α-SMA,以观察瓜蒌薤白白酒汤对心肌纤维化整体动物内皮–间质转化的影响,判断体外–体内实验结果是否具有一致性。结果：1.基于EndMT,心肌纤维化细胞模型的构建：在研究剂量范围100ng/mL～0.01ng/mL考察rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3对人冠状动脉内皮细胞活性的影响发现,rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3对HCAEC有着相同的作用,在加入细胞后48h(2d),对细胞活力产生一定的抑制作用(P<0.05-0.01),在研究剂量范围内,对HCAEC的抑制作用没有剂量梯度性,只是有与无的差别。细胞免疫荧光测定发现：HCAEC经rhTGFβ1诱导7d,CD31、FSP1阳性表达率分别为43.38%、56.60%,HCAEC经rhTGFβ2诱导7d,CD31、FSP1日性表达率分别为42.62%、56.20%,HCAEC经rhTGFβ3诱导7d,CD31、FSP1阳性表达率分别为46.00%、55.32%,rhTGFβ各组间比较没有显著性差异；流式检测发现：HCAEC经rhTGFβ1诱导7d,CD31、α-SMA阳性表达率分别为38.43%、49.13%,HCAEC经rhTGFβ2诱导7d,CD31、α-SMA阳性表达率分别为37.37%、48.07%,HCAEC经rhTGFβ3诱导7d,CD31、α-SMA阳性表达率分别为37.9%、50.50%,rhTGFβ各组间比较没有显著性差异；collagenI检测发现：经rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ310ng/mL诱导7d后,培养液上清中collagenI浓度分别达到了1.29、1.35、1.32μg/mL,rhTGFβ各组间比较没有显著性差异。可见,在体外,rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3有着相同的作用,均能诱导HCAEC发生表型的改变,从动脉内皮细胞向间质细胞转化,且诱导效果相近,但在组织环境中TGFβ1的含量明显高于TGF2、TGFβ3,且TGFβ1介导了胚胎时期心脏发育过程中的EndMT,所以本课题决定选取rhTGFβ1为心肌纤维化细胞模型构建中的诱导剂。在确定了诱导剂后,流式细胞分析术发现,随着诱导时间的延长,内皮细胞的标志CD31的表达逐渐减少,间质细胞的标志α-SMA的表达逐渐增加,但诱导效率并不随着剂量的增加而增加,剂量100ng/mL与10ng/mL有着相同的诱导效率,1ng/mL和0.1ng/mL的诱导效率低于10ng/mL,即诱导效率100ng/mL=1Ong/mL>1ng/mL>0.1ng/mL,所以诱导剂的最佳剂量为终浓度10ng/mL;以10ng/mL的rhTGFβ1在不同时间点诱导的α-SMA+司质细胞拟合曲线,计算出经rhTGFβ110ng/mL诱导7天为最佳作用时间。HCAEC经rhTGFβ1诱导7d,心肌纤维化各项指标collagenI、MMP-1/MMP-9表达明显增加。利用内皮-间质细胞转化构建心肌纤维化细胞模型的诱导剂为rhTGFβ1,作用剂量为1Ong/mL,作用时间为7天,可成功构建该细胞模型。2.心肌纤维化细胞模型的应用—瓜萎薤白白酒汤对心肌纤维化内皮-间质转化的影响：流式法和Westernblot法检测内皮细胞特异性标志CD31和间质细胞特异性标志FSP/a-SMA发现：HCAEC经rhTGFβ1诱导7天,可成功复制心肌纤维化模型,瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位可明显抑制内皮细胞的减少,使细胞保持内皮特性,并抑制其向间质细胞转化,与模型组比较,P<0.05-0.01,从而达到对EndMT的调控作用；通过新构建的心肌纤维化细胞模型,瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位可明显下调TGF-β通路的Smad1、Smad2和Notch通路的North1、Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL2表达(P<0.05-0.01),而达到抑制EndMT。说明瓜蒌薤白白酒汤通过Notch通路抑TGF-β通路而实现保护内皮细胞,阻断EndMT,抑制心肌纤纤维化。3.瓜萎薤白白酒汤抑制心肌纤维化内皮-间质转化的整体验证：利用结扎大鼠左冠状动脉前降支复制心肌纤维化动物模型,给予瓜蒌薤白白酒汤正丁醇部位三个剂量(6、12、24g生药/kg),连续4周。超声心动图显示,与模型组比较,瓜萎薤白白酒汤正丁醇组部位可明显降低LVID、LVEDV、LVESV和升高IVS、LVPW、EF、FS(P<0.05-0.01);还可改善模型大鼠的血流动力学水平,高剂量组可显著增力LVSP、±dp/dtmax、HR、SAP和DAP,同时中、高剂量可减少LVEDP,与模型组比较P<0.05～0.01；显著抑制心肌酶谱AST、LDH和CK-MB的增加,与模型组比较P<0.05；与模型组相比,瓜蒌薤白白酒汤高剂量组可见LVM、HM、LVMI、HMI的显著降低(P<0.05～0.01)；心脏组织病理学检查显示,瓜萎薤白白酒汤正丁醇组肌纤维排列较有序、整齐,心肌细胞轻度肥大,间质可见少量炎细胞浸润,间质纤维组织轻度增生,染色相对均匀,Masson染色法显示瓜蒌薤白白酒汤正丁醇中、高剂量组心肌细胞数目明显增多,排列规则有序,心肌组织蓝色胶原染色部分较模型组有所减少;瓜蒌薤白白酒汤正丁醇中、高剂量组的CVF值和羟脯氨酸含量较模型组明显降低；瓜萎薤白白酒汤正丁醇组大鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRM表达量较模型组心肌组织中的表达量显著降低(P<0.05～0.01)。可见,瓜萎薤白白酒正丁醇部位对心肌纤维化大鼠有明显的保护作用,这为以后开展将瓜萎薤白白酒汤应用于本课题新构建的心肌纤维化细胞模型的应用确立了前期实验基础。整体实验发现,瓜蒌薤白白酒汤可显著降低TGF-β1的表达,抑制心肌纤维化所致CD31表达的减少和α-SMA/FSP1表达的增加(P<0.05～0.01),这一结果与体外实验是一致的,瓜蒌薤白白酒汤通过抑jEndMT实现抗心肌纤维化作用。说明通过新构建的心肌纤维化细胞模型所得的研究数据是真实、可靠、可信的。结论：构建基于内皮-间质细胞转化的心肌纤维化细胞模型的方法为：以人冠状动脉内皮细胞为基础细胞,rhTGFβ1为诱导剂,在终浓度为10ng/mL的诱导剂作用7天时,动脉内皮细胞可转化为间质细胞,表达间质细胞特异性标志,并高表达心肌纤维化相关指标。将该方法成功应用于瓜蒌薤白白酒汤对心肌纤维化的研究,结果发现瓜萎薤白白酒汤明显抑制心肌纤维化过程中的内皮-间质细胞转化,对内皮细胞有一定的保护作用;进一步研究发现瓜蒌薤白白酒汤通过Notch通路抑制TGF-β通路而实现保护内皮细胞,阻断EndMT,抑制心肌纤维化作用。
【作者】丁永芳；
【导师】许惠琴；方泰惠；
【作者基本信息】南京中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】心肌纤维化；细胞模型；内皮-间质转化；瓜蒌薤白白酒汤；

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