麦冬皂苷类成分对NSCLC的体外抑制作用及相关机理研究

【摘要】非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要类型,约占其75.0%的比例。在NSCLC中,鳞癌与腺癌所占的比例又是最高的,约占80.0%以上。中医药在癌症的治疗中对于稳定瘤体、改善症状、防止复发和提高生活质量等方面具有独到的优势,但其作用机理仍有待进一步阐明,科学化使用程度有待进一步提高。“麦门冬汤合千金苇茎汤”(来自《金匮要略》)及“周氏克金岩方”(来自国医大师周仲瑛教授)均为临床抗肺癌的有效验方,前期动物实验研究结果表明,其均能抑制Lewis肺癌及A549、H157肺癌荷瘤小鼠模型体内肿瘤的生长。在这两张抗肺癌的重要方剂中,麦冬均作为一味不可或缺的中药组分,课题组前期对其有效部位及活性成分抗非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)的作用进行了细胞水平的高通量筛选,结果表明其皂苷类成分具有显著的体外抗NSCLC的作用,但其相关机理有待进一步研究。本研究以NSCLC中普遍过度活化的PI3K/Akt/mTOR信号通路为切入点,通过研究麦冬皂苷类细胞毒成分对NSCLC中鳞癌、大细胞癌和腺癌等不同病理分型细胞株的药理学活性及差异,揭示中药有效成分抗NSCLC的机理,同时为临床分子靶向性治疗药物的研究和开发提供一定的理论基础。本论文具体开展工作如下：1鲁斯可皂苷元(Ruscogenin)、麦冬皂苷B(ophiopogoninB,OP-B)、麦冬皂苷D(ophiopogoninD,OP-D)三种麦冬皂苷体外抗NSCLC活性的初步筛选以肺鳞癌细胞株NCI-H157为研究对象,通过药物作用后进行细胞周期检测和对PI3K/Akt/mTOR信号通路进行分析,对三种麦冬皂苷类化合物Ruscogenin、OP-D和OP-B抗NSCLC的药理学活性进行初步的筛选。结果表明：OP-D各给药浓度、给药时间对细胞周期没有显著影响；Ruscogenin和OP-B在给药24h后导致NCI-H157细胞周期阻滞在G0/G1期；在对PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用上,Ruscogenin对整条通路没有显著影响,OP-D对该通路下游的eIF4B有显著激活作用,而OP-B则主要抑制通路上游Akt和p70S6K的磷酸化激活,对下游的eIF4B及eEF2K的磷酸化没有显著影响。2OP-B对肺鳞癌细胞株NCI-H157和大细胞肺癌细胞株H460药理活性的研究倒置显微镜进行形态学观察发现其能诱导这两种细胞株发生空泡样死亡,cleavedCaspase-3、Bcl-2等的Westernblot检测以及Annexin-V/PI/Hoechest33258荧光染色结合高内涵分析发现该死亡方式不属于凋亡。自噬金指标LC3-Ⅰ向Ⅱ转化水平的Westernblot检测结合自噬空泡的电镜观察结果证明OP-B在H157和H460细胞株中诱导的均为Ⅱ型程序性死亡,即自噬。通过对调控自噬的关键信号通路PI3K/Akt/mTOR的检测结果发现OP-B对通路中Akt和p70s6k的磷酸化抑制均呈现时间和剂量依赖关系。通过和PI3K的抑制剂LY294002以及mTOR抑制剂Rapmycin进行比较,并通过胰岛素对信号通路进行给药后诱导,发现OP-B对Akt磷酸化的抑制作用较为专一,且是OP-B诱导自噬的原因。3OP-B对肺腺癌细胞株A549的自噬和凋亡诱导活性研究临床肺腺癌的发病率最高,治疗最为棘手,在OP-B对肺腺癌细胞株A549的作用中发现,OP-B通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,早期诱导细胞自噬,进而诱导其发生凋亡,而且通过对自噬关键蛋白Beclinl的SiRNA干扰实验证明,自噬是导致细胞凋亡的关键因素。4OP-B对H460和A549细胞周期调控的差异性比较进一步对OP-B在A549和H460细胞株中的周期调控情况进行比较,发现OP-B在A549中主要通过上调周期抑制蛋白p21和p27的表达和抑制CyclinA2、CDK2、CyclinBl的表达诱导细胞周期阻滞在S和G2/M期；而在H460中,OP-B对周期的调控较弱,主要通过抑制CyclinB1的表达,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。5OP-B对A549细胞侵袭及迁移的体外研究细胞划痕实验和Transwell实验表明,OP-B在诱导A549细胞凋亡的同时,还抑制细胞的侵袭和迁移。并且对细胞迁移的调控和调节Akt的磷酸化及EphA2受体的表达有一定关联。结论在几种麦冬甾体皂苷类化合物中,二糖苷OP-B为主要的细胞毒成分,其对于不同病理分型的NSCLC细胞株具有不同的药理学活性。在肺鳞癌和大细胞癌细胞株中,OP-B主要诱导细胞发生自噬；而在肺腺癌细胞株中,OP-B早期诱导细胞自噬,晚期诱导细胞发生凋亡。通过对OP-B在三种NSCLC细胞株中作用机制的差异性比较发现,其主要差别在于对细胞周期的调控上,在H157和H460中主要诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,而在A549中则将细胞周期阻滞在S和G2/M期。通过对p-Akt的抑制,OP-B在诱导A549细胞发生凋亡的同时,还能抑制细胞的侵袭和迁移。在分属鳞癌、大细胞癌和腺癌三种不同病理亚型的NSCLC细胞株中,OP-B对肺腺癌最敏感。
【作者】陈美娟；
【导师】张旭；
【作者基本信息】南京中医药大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】麦冬甾体皂苷；麦冬皂苷B；自噬；凋亡；PI3K/AKT/mTOR信号通路；细胞迁移；

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