棉花亚棉A细胞质雄性不育系的不育机理研究

【摘要】棉花是重要的经济作物,具有十分明显的杂种优势。而细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)不仅是植物杂种优势利用的基础,而且是生物学领域研究的热点之一,对了解植物生命活动的遗传机制有重要意义。本研究对棉花亚棉A细胞质雄性不育系及其同核异质保持系进行了形态学、细胞学、遗传学、生理生化、差异转录组学以及差异蛋白质组学等方面的研究,首次采用转录组与蛋白质组相结合的方法,从“组学”角度解析棉花亚棉A细胞质雄性不育的分子机制,主要结果如下：1.花器形态观察表明：不育系和保持系花器形态差异比较明显,不育系亚棉A的花药瘦小,深褐色,花药皱缩不开裂,无花粉散出,但雌蕊发育正常；保持系亚棉B的花药肥大饱满,乳黄色,开裂后花粉散出布满整个花药。亚棉A与亚棉B的花器官中,花瓣宽度和子房直径差异达到显著水平,而花朵鲜重、花瓣长度、花瓣长×宽、柱头长度、花丝长度、花药长度、花药宽度、花药长×宽指标的差异达到了极显著水平。2.对亚棉A、哈克尼西棉和晋A三种细胞质雄性不育系进行了线粒体RAPD分析,结果发现引物E89397在3个不育系中分别扩出了3种不同的条带图谱,表明这3个不育系的线粒体DNA之间有差异,分别为不同的胞质不育类型。3.细胞学研究表明：不育材料亚棉A的败育时期主要在造孢细胞期至减数分裂细线期前；在显微结构上,败育迹象起始于造孢细胞期,造孢细胞粘连,无核仁,部分已解体,未解体造孢细胞发育成的小孢子母细胞中核仁消失,在减数分裂细线期前完全解体,而绒毡层细胞延迟发育,且与中层细胞在整个花药发育过程中不降解,这些异常现象导致最终形成无花粉粒的花粉囊；在亚显微结构上,造孢细胞和小孢子母细胞中出现线粒体内嵴消失、内质网断裂等降解迹象的同时,相应绒毡层细胞中也出现了线粒体退化的异常现象。绒毡层细胞延迟发育可能是引起亚棉A小孢子败育的主要原因。4.生理生化研究表明：生化指标和光合指标的变化与育性相关。在酶活性方面,不育系败育后花蕾中的过氧化物酶活性显著高于保持系,而其琥珀酸脱氢酶活性却明显低于保持系；不育系的叶片和不同发育时期花蕾中超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶活性均低于保持系。在光合特性方面,从蕾期到吐絮期的生育期内,不育系亚棉A叶片中净光合速率均低于相应保持系亚棉B；不育系叶片的蒸腾速率和胞间C02浓度除在蕾期高于保持系外,其余时期均低于保持系；不育系叶片上的气孔导度在蕾期和吐絮期均明显高于保持系,在花期和铃期却低于保持系；不育系亚棉A叶片中的水分利用率除在花期明显高于保持系外,其余生育时期均低于保持系。5.以亚棉A的花蕾和叶片为材料,对比分析了CTAB法、热硼酸法及5个不同生物公司的RNA提取试剂盒提取的RNA的完整性和纯度,结果发现北京艾德莱生物公司的RN09和RN37试剂盒提取的棉花花蕾总RNA完整性较好,纯度、得率较高,比其它方法和试剂盒更适宜提取棉花花蕾的总RNA。6.采用cDNA-AFLP技术,对不育系亚棉A及其保持系亚棉B败育前、中、后期的花蕾进行了转录组研究,聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测到550条差异条带,其中亚棉A败育中期特有差异条带有226条,占总差异条带的41.09%；这些差异表达条带在不育系和保持系不同发育时期花蕾中表达,既存在量的差异,也有质的区别,从中选取132个TDFs经回收、二次扩增、克隆测序后获得99个TDFs的核苷酸序列,其中98个TDFs能在NCBI数据库中搜索到同源序列；theGeneOntology分析发现这些差异片段主要参与分解代谢、生物合成、内质网应激反应等生物过程,位于线粒体、质外体、叶绿体等细胞组分中,涉及分子结构活性、转录调控、抗氧化活性等分子功能；参与了β-丙氨酸代谢、RNA降解、蛋白质运输和碳代谢等途径。推测这些差异表达基因可能与亚棉A的育性相关。7.随机选取cDNA-AFLP中的7个差异表达片段,应用半定量RT-PCR和荧光定量PCR进行表达模式验证,结果显示所选取差异片段的RT-PCR结果与qRT-PCR结果一致,且与cDNA-AFLP的分析结果相同。这些实验结果证明cDNA-AFLP技术的可靠性和进行该项研究的可行性。8.采用cDNA-AFLP、TAIL-PCR和3’-RACE3种技术从棉花细胞质雄性不育系亚棉A中克隆了1个ClassⅢ过氧化物酶基因的cDNA全长,将其命名为GhPrx65。该基因序列全长为1275bp,编码一个拥有334个氨基酸的蛋白。序列分析发现,GhPrx65同可可的ClassⅢ过氧化物酶的一致性最高,具有一个近端的亚铁血红素配基保守域、8个保守的半胱氨酸残基,存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点。半定量和荧光定量PCR分析发现,该基因也只在不育系造孢细胞期的花药中表达。推测ClassⅢ过氧化物酶基因GhPrx65可能在不育系花药发育过程中发挥了一定作用,与不育系的败育相关。9.对蛋白提取和双向电泳体系进行了优化,获得了一种适合棉花花蕾蛋白质提取和双向电泳的技术体系：即用改良的苯酚提取法提取棉花不育系及保持系花蕾总蛋白质,双向电泳用24cm、pH3-10NL的IPG预制胶条,蛋白上样量为800ug,最后获得高清晰度和分辨率的pH3-10NL范围的蛋白质表达图谱。10.采用优化的双向电泳、质谱鉴定以及生物信息学等技术对亚棉A不育系及其保持系进行了差异蛋白质组学分析。经PDQuest8.0.1分析,不育系与保持系两个败育关键时期花蕾即A2、B2、A3、B3的双向电泳图分别检测到1013、1110、1112、1127个蛋白斑点。通过差异比较和统计学分析,A2与B2间有5个差异表达蛋白,A3与B3间有9个差异表达蛋白。选取其中11个差异表达蛋白质斑点进行质谱分析,这些差异蛋白主要参与碳水化合物和能量代谢、内质网应激反应和过氧化氢的应答等生物过程,位于线粒体、叶绿体等细胞组分中,主要在与金属离子结合上起着重要作用,涉及光合生物固碳和二羧酸代谢、糖酵解和糖异生代谢等代谢途径。推测这些差异蛋白质可能与亚棉A的育性相关。mRNA水平研究显示差异蛋白基因在不育系与保持系花药发育的7个时期都有表达,表达高峰期主要位于3时期之前；这些基因表达量与其蛋白表达量不完全一致可能是由基因转录后加工及翻译后蛋白修饰等造成的。11.利用回交转育法,以棉花细胞质雄性不育系亚棉A为不育源,转育出4个遗传稳定的BC6胞质不育系YMA1-YMA-1、YMA2、YMA7和其保持系YMB1、YMB-1.YMB2、YMB7。采用测交筛选法选育出亚棉A的恢复材料10N93R、10N91R,进行NCⅡ交配,配制出5个杂种组合,初步实现了三系配套。10N93R、10N91R对胞质不育系育性恢复的遗传模式研究发现,(A×R)F2世代的育性分离比为13：3和3：1,(A×R)F1×B或Ax(A×R)F1测交群体的育性分离比为2：2,推测亚棉A的育性恢复可能受两对独立遗传的基因控制,其中部分显性基因作用的发挥与不育系的核背景相关。
【作者】赵海燕；
【导师】黄晋玲；
【作者基本信息】山西农业大学，作物遗传育种，2013，博士
【关键词】棉花；细胞质雄性不育(CMS)；细胞学；生理生化；cDNA-AFLP；蛋白质组学；遗传学；

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