调控长春花生物碱合成的WRKY转录因子鉴定及功能分析

【摘要】长春花(Catharanthusroseus,C.roseus)既是一种重要的药用植物,也是萜类吲哚生物碱(TerpenoidIndoleAlkaloids,TIAs)次生代谢研究的主要模式植物。因此,研究长春花TIAs合成积累及其转录调控机制具有重要的意义和广阔的应用前景。WRKY是调控次生物质代谢和逆境胁迫反应等生命活动的一个转录因子大家族。然而,有关长春花CrWRKY转录因子的种类和功能以及是否参与调控TIAs生物合成等却知之甚少。为此,本文综合应用分子生物学、生物化学和生物信息学等技术对长春花全基因组WRKY转录因子的种类、结构特征和表达图谱以及介导长春花TIAs生物合成调控的CrWRKYl基因启动子进行了系统研究。本研究不仅加深了人们对长春花WRKY转录因子的认识,而且为进一步解析长春花WRKY转录因子的功能和TIAs合成调控网络奠定了基础。1.以幼叶为外植体,建立了发根农杆菌R1000介导的高效毛状根转基因体系。报告基因GUS染色及PCR扩增分子鉴定表明,发根农杆菌R1000介导长春花幼叶产生毛状根系的转基因方法可使发根诱导率和阳性转化率提高到82±2.49%和100%。该转化方法所获得毛状根系数量大、质量高、遗传稳定且所需时间短,明显优于已有的长春花遗传转化技术。这为研究长春花TIAs生物合成调控机制及其相关基因功能鉴定和抗癌生物碱代谢工程建立了一种新的高效便捷的遗传转化体系。2.应用生物信息学分析工具从长春花26009个单拷贝蛋白序列中鉴定出47个CrWRKY转录因子。依据WRKY结构域和锌指结构,将CrWRKY分为G1、G2和G3三大类群。第1类群包括11个CrWRKY成员。第2类群又可以分为G2-a、G2-b、G2-c、G2-d和G2-e5个亚类群,共31个成员。第3类群包括5个CrWRKY蛋白,全部属于G3-a亚类。不同CrWRKY成员中WRKY域基序(WRKYGQK)是高度保守的。然而,锌指结构具有多样性。第1和第1Ⅱ类群CrWRKY成员锌指结构为C2H2型,其中GlN锌指结构的序列为C-X4-C-X22-H-X1-H,G1C和G2-c为C-X4-C-X23-H-X1-H,G2-a.G2-b.G2-d和G2-e为C-X5-C-X23-H-X1-H.第Ⅲ类群成员的锌指结构为C2HC型,序列为C-X7-C-X23-H-X1-C。3.数字基因表达谱分析和实时荧光定量PCR检测表明,长春花CrWRKY基因的表达具有器官特异性。.47个CrWRKY基因的表达谱可分为3种表达模式。CrWRKY参与长春花萜类吲哚生物碱(TIAs)合成的调控,且受MeJA和YE信号的影响。鉴定出一组调控长春花TIAs生物合成的候选CrWRKY转录因子。4.在长春花CrWRKY1转录因子分离和功能鉴定的基础上,应用DNA步移法克隆到CrWRKYl基因启动子序列(524bp),并通过多种分子生物学实验重点解析了CrWRKY1基因启动子的结构和功能。生物信息学分析揭示该启动子包含许多真核生物调控顺式元件,如bHLH结合序列E-box、MYB识别元件、DOF识别的核心序列、损伤响应元件WRE和激活序列因子元件ASF-1等。5’-RACE确定转录起始点(TSS)位于翻译起始位点(ATG)上游113bp处。5’和3’-片段缺失及突变驱动GUS基因在长春花原生质体中瞬间表达分析显示,随着启动子缺失序列的增加,GUS活性逐渐减小。缺失至-93bp(deD)时,活性比全长启动子活性降低了2.5倍。从-93至+113bp区域仅有CT富集元件,具有最低启动子活性,为最小功能启动子区域。除位于-100bp到-95bp的ASF-1外,其他顺式元件的突变均降低启动子活性。M4(位于-127bp到-120bp的ASF-1)和M6(位于+26至+41bp的CT富集元件)双突变的启动子活性最小,仅为全长启动子活性的7%。可见,CrWRKYl基因启动子结构紧凑且含有多种顺式调控元件,暗示了CrWRKYl基因的表达可能受多种因子的调控。5.进一步应用长春花转基因毛状根系和转基因烟草对CrWRKYl启动子及其突变的功能鉴定表明,野生型(WT)启动子能有效驱动报告基因在长春花毛状根系和烟草及拟南芥植株中表达,片段缺失突变的表达活性与在长春花原生质体中测试结果相似。另一重要发现是WT启动子和片段缺失突变(delC)的表达活性受MeJA诱导,MeJA处理的长春花转基因毛状根中GUS活性比对照增加1.2倍。CrWRKYl启动子中JA响应元件定位于TSS上游-140bp到-93bp之间。显然,转录因子CrWRKY1参与JA信号介导的长春花TIAs生物合成调控网络。6.酵母单杂交筛选到能与启动子互作的因子S1FA等。依据CrWRKYl启动子顺式元件,克隆到MYB44和DOF等潜在的与CrWRKYl启动子互作的蛋白基因。上述CrWRKYl基因启动子的研究不仅丰富和拓展了长春花TIAs生物合成调控的理论,而且为进一步鉴定能与该启动子互作的调节因子和全面认识TIAs及抗癌生物碱的合成途径及其调控机制奠定了基础。
【作者】杨致荣；
【导师】李润植；袁凌；
【作者基本信息】山西农业大学，作物遗传育种，2013，博士
【关键词】WRKY转录因子；萜类吲哚生物碱；毛状根转化体系；启动子分析；酵母单杂交；原生质体瞬间表达；长春花；

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