褪黑素在创伤性脑损伤中神经保护作用及其机制的研究

【摘要】继发性脑损伤是决定创伤性脑损伤患者预后的主要因素,其损伤机制包括氧化应激、炎症反应、神经兴奋性毒性、钙离子失稳态和凋亡等多种级联放大反应。以往的治疗措施都只能针对其中某一种机制通路发挥作用,同时忽视调节机体内在自我保护机制。因此目前针对单一的损伤机制不能取得满意疗效。褪黑素对于多种神经系统疾病有明确的保护作用。其作用机制涵盖了TBI后继发性损伤的多种病理进程,同时其也可以激活了机体内在的多种自我保护机制。因此,本研究提出在TBI中使用褪黑素,可以拓展褪黑素的作用机制,为TBI的临床治疗提供新的方向。第一部分褪黑素在创伤性脑损伤后氧化应激中的作用及其机制氧化应激参与了TBI后的继发性损伤,本部分旨在研究褪黑素对创伤性脑损伤后的氧化应激的作用,并探究其作用机制。本部分包含两项研究。研究一褪黑素在TBI后激活Nrf2-ARE信号通路缓解了氧化应激目的：观察TBI后使用褪黑素的神经保护作用和褪黑素对Nrf2-ARE信号通路的激活。方法：成年雄性ICR小鼠为实验动物,采用自由落体模型,分为假手术组(sham)、外伤组(TBI)、外伤+溶剂剂组(TBI+V)和外伤十褪黑素组(TBI+M)(n=38/每组)。伤后24h对各组取挫伤灶周围皮层,干湿重比值法检测脑水肿；FJC荧光检测伤灶周围神经元变性；酶标法检测氧化应激指标：MDA、SOD和Gpx；免疫荧光检测3-NT、Nrf2和HO-1在伤灶周围皮层的表达；分别提取核蛋白和浆蛋白,westernblotting检测核浆蛋白中Nrf2的表达以及HO-1和NQO-1在浆蛋白中的表达；RT-PCR检测伤灶周围皮层HO-1和NQO-1在mRNA水平的表达；EMSA法检测Nrf2的转录活性。结果：外伤后的小鼠较假手术组脑水肿、神经元变性、氧化应激水平明显增加；外伤组和外伤+溶剂组无差别；使用褪黑素可以逆转上述损伤指标。外伤后Nrf2-ARE信号通路被激活：Nrf2蛋白核/浆比明显升高,转录活性上升,其下游HO-1和NQO-1在蛋白和mRNA水平升高；使用褪黑素后Nrf2-ARE信号通路活性更强。结论：TBI后使用褪黑素可以增强Nrf2-ARE信号通路的活性,机体抗氧化能力增强,抑制了神经元变性,减少了脑水肿。研究二Nrf2-ARE信号通路在褪黑素缓解TBI后氧化应激中的作用目的：研究一证实了褪黑素可以强化Nrf2-ARE信号通路活性。但是Nrf2-ARE信号通路在褪黑素TBI后抗氧化应激的作用还不明确。因此Nrf2基因敲除小鼠被引入本研究,来证实rf2-ARE信号通路在褪黑素抗氧化应激中的作用。方法：实验动物为Nrf2野生型[Nrf2(+/+)]和Nrf2基因敲除[Nrf2(-/-)]小鼠(n=35/每组)。小鼠自由落体模型致伤。分组为：野生型组[Nrf2(+/+)]和基因敲除组[Nrf2(-/-)]。两组均行自由落体致伤和伤后腹腔注射褪黑素。伤后24h对各组取挫伤灶周围皮层,干湿重比值法检测脑水肿；FJC荧光检测伤灶周围神经元变性；酶标法检测氧化应激指标：MDA、SOD和Gpx；免疫荧光检测3-NT。结果：基因敲除小鼠较野生型小鼠神经元变性、氧化应激水平明显增加；脑水肿无统计学差异。结论：敲除Nrf2,褪黑素的神经保护作用明显减弱,Nrf2-ARE信号通路在褪黑素抗氧化应激中起着重要作用。第二部分褪黑素在创伤性脑损伤后炎症中的作用及其机制目的：炎症参与了TBI后的继发性损伤,本部分旨在研究褪黑素对创伤性脑损伤后的炎症的作用,并探究其作用机制。方法：成年雄性ICR小鼠为实验动物,采用自由落体模型,分为假手术组(sham)(n=35)、外伤组(TBI)(n=35)、外伤+生理盐水组(TBI+sal)(n=45)和外伤+褪黑素组(Mel)(n=45)。伤后24h和72h对外伤+生理盐水组(TBI+sal)和外伤+褪黑素组(Mel)进行神经功能评分(NSS),伤后24h对各组取挫伤灶周围皮层,干湿重比值法检测脑水肿；IBA-1免疫荧光检测小胶质细胞数量和活化状况；ELISA法检测炎症细胞因子(TNF-a和IL-1p)蛋白含量；westernblotting法检测mTOR信号通路蛋白含量(总的和磷酸化的mTOR、p70s6和S6RP);S6RP和IBA-1免疫荧光双染观察mTOR信号通路在小胶质细胞活化中的作用。结果：外伤后的小鼠较假手术组神经功能障碍、脑水肿、神经元减少、小胶质细胞活化明显增加；使用褪黑素可以抑制上述损伤；外伤后mTOR信号通路明显激活,而褪黑素可以抑制外伤所致的mTOR信号通路活化。结论：褪黑素可以通过减少mTOR信号通路的活性抑制外伤后的小胶质细胞活化,减少炎症细胞因子的释放,从而缓解神经元丢失,改善神经功能障碍。第三部分褪黑素在创伤性脑损伤后细胞凋亡中的作用及其机制细胞凋亡是TBI后的继发性损伤的一个重要病理事件,抑制凋亡可以产生明确的神经保护作用。本部分旨在研究褪黑素对创伤性脑损伤后细胞凋亡的作用,并探究其作用机制。本部分包含两项研究。研究一褪黑素在TBI对自噬的影响目的：本部分旨在研究褪黑素对创伤性脑损伤后的自噬的作用,观察其是否可以激活自噬；并探讨自噬的神经保护作用。方法：成年雄性ICR小鼠为实验动物,采用自由落体模型,分为假手术组(sham)(n=11)、外伤组(TBI)(n=11)、外伤+生理盐水组(TBI+sal)(n=21)和外伤+褪黑素组(Mel)(n=21)。NSS进行神经功能评分；westernblotting法检测自噬标志物(LC3、Beclin-1)蛋白含量；LC3和NeuN免疫荧光双染观察自噬是否在神经元激活。结果：TBI后的小鼠较假手术组LC3、Beclin-1表达明显增高,免疫荧光中自噬体(LC3)主要表达在神经元,TBI后自噬体增多。TBI导致神经功能障碍明显增加。外伤+褪黑素组小鼠较外伤+生理盐水组的小鼠自噬增强,神经功能障碍明显改善。结论：褪黑素可以通过激活自噬改善神经功能障碍。研究二自噬在褪黑素抗TBI后细胞凋亡中的作用及其机制目的：本部分旨在研究褪黑素对创伤性脑损伤后的线粒体途径凋亡的作用,探讨褪黑素激活自噬,取得神经保护作用的机制。方法：成年雄性ICR小鼠为实验动物,采用自由落体模型,分为假手术组(sham)、外伤+生理盐水组(TBI+sal)、外伤+3MA组(TBI+3MA)、外伤+褪黑素组(Mel)和外伤+褪黑素+3MA组(Mel+3MA)(n=26/每组)。伤后1天、3天和7天进行神经功能评分(NSS),伤后24h对各组取挫伤灶周围皮层,提取总蛋白、线粒体蛋白和去线粒体蛋白,免疫荧光原味末端标记法(TUNEL)检测伤灶周围细胞凋亡,westernblotting法检测总蛋白的自噬标志物(LC3、Beclin-1)、活化的caspase-3含量以及线粒体内外的Bax、cyt-c蛋白含量。结果：TBI后使用褪黑素较单纯外伤组在1天和3天NSS评分显著升高,而3MA明显抑制了褪黑素对TBI的神经功能保护作用；TBI后使用褪黑素可以抑制细胞凋亡,3MA明显抑制了褪黑素的抗细胞凋亡作用；外伤+3MA组较外伤+生理盐水组,外伤+褪黑素+3MA组较外伤+褪黑素组LC3、Beclin-1表达明显降低,表明使用3MA明显抑制了自噬；TBI后的小鼠较假手术组活化的caspase-3蛋白表达明显增高,使用褪黑素可以抑制caspase-3的活化,而3MA逆转了褪黑素的抑制caspase-3活化作用；TBI后的小鼠较假手术组线粒体内Bax蛋白表达明显增高,使用褪黑素可以抑制线粒体内Bax的升高,3MA逆转了褪黑素的作用；TBI后的小鼠较假手术组线粒体外cyt-c蛋白表达明显增高,使用褪黑素可以抑制线粒体外cyt-c的升高,3MA逆转了褪黑素的作用。结论：褪黑素可以通过减少外伤后线粒体内Bax和线粒体外cyt-c的升高抑制外伤后的细胞凋亡；抑制自噬逆转了褪黑素对线粒体途径凋亡的抑制作用。
【作者】丁可；
【导师】王汉东；
【作者基本信息】南京大学，外科学，2014，博士
【关键词】创伤性脑损伤；褪黑素；继发性损伤；氧化应激；炎症反应；凋亡；自噬；

【参考文献】
[1]轩永波,黄长强,吴文超,王勇,翁兴伟,李望西.多无人机协同搜索随机目标决策[J].控制与决策,2013,05:711-715.
[2]刘亚梅.生本教育理念下的初中地理教学策略研究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[3]陈东强.重庆市南川区土地节约集约利用研究[D].西南大学,土地资源管理,2013,硕士.
[4]敬乐.川中地区营山构造须二气藏天然气富集规律研究[D].成都理工大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[5]刘伟.认知无线电系统中基于Markov模型的频谱接入技术研究[D].南京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[6]邢燕.在役结构在未来地震中的损失估计[D].西安建筑科技大学,结构工程,2004,硕士.
[7]范婷婷.基层公务员职业倦怠问题研究[D].河北经贸大学,行政管理,2014,硕士.
[8]薛妍.指定居所监视居住制度研究[D].中国社会科学院研究生院,刑事诉讼法学（专业学位）,2014,硕士.
[9]姚丽丽.稀土掺杂NaYF_4基质上转换发光材料的制备与光学性质研究[D].广东工业大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[10]杨晨.Cu掺杂ZnO稀磁半导体的制备、微观结构和磁特性研究[D].复旦大学,粒子物理与原子核物理,2011,硕士.
[11]汪馥慧.“过来”“过去”的比较研究[D].复旦大学,语言学及应用语言学,2012,硕士.
[12]王一江.双模式微电网逆变器控制策略研究[D].北京交通大学,2014.
[13]李为为.城市轨道交通调度指挥智能集成系统研究[D].北京交通大学,2006.
[14]张斌.T0.1标准下改善90nm 3.3V NMOS热载流子注入（HCI）效应[D].上海交通大学,集成电路工程,2013,硕士.
[15]廖方楠.业绩竞赛、地方国企过度投资和城市商业银行贷款[D].重庆大学,会计学,2014,硕士.
[16]于玥.企业并购风险内部控制研究[D].河北大学,会计,2014,硕士.
[17]黄河.企业竞争力的评价及提升研究[D].河海大学,技术经济及管理,2004,硕士.
[18]成泽枫.中国基础养老金全国统筹问题研究[D].苏州大学,社会保障,2014,硕士.
[19]范晨辉.开发性金融支持黑龙江省新材料行业融资策略研究[D].哈尔滨工业大学,金融,2014,硕士.
[20]邬晓燕.绿色发展及其实践路径[J].北京交通大学学报(社会科学版),2014,03:97-101.
[21]曾志成.两种不同桩锚支护体系受力机理的数值研究[D].长安大学,岩土工程,2014,硕士.
[22]徐乾宇.中国国际投资头寸分析[D].上海社会科学院,金融学,2012,硕士.
[23]赵方超.复合铁酶促活性污泥强化生物脱氮除磷技术的试验研究[D].青岛理工大学,市政工程,2012,硕士.
[24]王鹏飞.纪录片题材选择研究[D].南京航空航天大学,广播电视艺术学,2013,硕士.
[25]董盛昕.开关阀控双作用式气动阀门定位器控制研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[26]彭民建.生态住宅中污水处理回用装置的研究[D].东华大学,环境工程,2004,硕士.
[27]方江晓.短期风速和风电功率预测模型的研究[D].北京交通大学,2011.
[28]孙凯.大型风力发电机组流固耦合尾迹特性分析[D].上海电力学院,热能工程,2014,硕士.
[29]王爵鹤,姜渭中,周成浦.高浓度胶结充填料管道水力输送[J].长沙矿山研究院季刊.1981(01)
[30]张林.QR Code二维条码模式特征分析及其姿态的快速确定[D].湖北大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[31]付长明.QPQ盐浴复合处理技术对3Cr2W8V热作模具钢耐磨耐蚀性的研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[32]萨仁.关于初中《语文》中民间文学的选用[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[33]詹鹏.槐耳浸膏联合重组人血管内皮抑素逆转人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性的研究[D].大连医科大学,肿瘤学,2012,硕士.
[34]李磊.论我国酒后驾车的行政规制[D].湖北大学,宪法学与行政法学,2011,硕士.
[35]石嘉川.基于模糊评价的配电网络多目标优化研究[D].山东大学,2007.
[36]孔冠庆.某三级医院临床信息系统建设及应用研究[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2013,硕士.
[37]本报记者郭培宽.贸易战升级各国货币竞相贬值资源题材股机会有待深挖[N].通信信息报,2010-10-13C02.
[38]黄秋菊.大学校园标语的育人功能研究[D].海南大学,思想政治教育,2014,硕士.
[39]赵立立.新中国成立以来中国共产党生态思想的嬗变[D].西南大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[40]李荣霞.莪术油诱导卵巢癌上皮细胞系凋亡及其对STAT信号传导通路的影响[D].河北医科大学,妇产科学,2013,硕士.
[41]肖玲.探矿会议[J].石油地球物理勘探,1976,S1:41-45.
[42]张月.改革开放后的女性民乐演奏家研究[D].中国艺术研究院,音乐学,2013,硕士.
[43]王慧娟.幼儿园教材中幼儿用书的分析与研究[D].内蒙古师范大学,学前教育学,2013,硕士.
[44]张瑜.基于Copula函数的提前还贷违约风险相关性研究[D].东北大学,金融学,2010,硕士.
[45]王颖.汽车导航系统中检索的设计及实现[D].内蒙古大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[46]李政鸿.胸腔镜下肺癌手术淋巴结清扫数目与术后胸引量关系的探讨[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[47]彭秋.红塔集团昭通卷烟厂烟叶仓储害虫发生规律及防治技术研究[D].湖南农业大学,作物学,2012,硕士.
[48]赵彩宏,郭风,郭文勇,黄晓华,刘昕,肖立业,林良真,余运佳.基于电压补偿原理的超导储能-限流集成系统[J].电力系统自动化,2006,02:68-71+108.
[49]吉庆勋.脐橙果皮光泽型突变体及相关基因克隆与表达分析[D].江西农业大学,果树学,2012,硕士.
[50]刘蕊.环境设计专业人才培养研究[D].河北大学,设计学,2014,硕士.