奶牛肽聚糖识别蛋白与溶菌酶基因克隆表达及其SNP与SCS关联分析

【摘要】奶牛乳房炎是以致病菌为主要因素导致的乳房炎症，是产奶业中危害最大的疾病之一。而在导致乳房炎的致病菌中，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌比例最高。在奶牛天然免疫系统中，肽聚糖识别蛋白与溶菌酶家族是两种非常重要的模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR），能够识别来源于致病菌的病原体相关分子模式（PathogenAssociatedMolecularPattern，PAMP）——肽聚糖，在防御病原入侵和清除病原等方面具有重要作用。本研究利用基因组DNA扩增肽聚糖识别蛋白基因序列，通过测序检测序列中多态位点，采用PCR-RFLP技术对SNP位点分型、并与体细胞评分（SCS）、平均日产奶量、乳脂率、乳蛋白率关联分析，旨在筛查与奶牛乳房炎抗性及产奶性状相关的SNP标记，为今后奶牛抗病育种提供理论依据。同时，利用生物信息学，分子生物学以及基因工程等技术克隆肽聚糖识别蛋白家族4个成员以及溶菌酶家族中6种亚型，并尝试使用酵母真核表达系统及大肠杆菌原核表达系统进行表达，对成功表达的蛋白进行纯化与抗菌试验。旨在探索肽聚糖识别蛋白与溶菌酶对奶牛乳房炎常见病原微生物的抗菌能力，为奶牛乳房炎新型抗菌药物研发提供理论与技术依据。主要研究结果与结论如下：1.PGLYRP1基因多态性及其与SCS、产奶性状关联分析在PGLYRP1基因全长序列中共确认了10个SNP位点，关联分析表明T-35A、T-12G和G+102C与SCS关联（P<0.05），而G+102C和G+649C与平均日产奶量相关联（P<0.05）。对单倍型组合的关联分析表明H3H3与较低SCS相关联（P<0.01），而H2H2与较低平均日产奶量相关联（P<0.01），因此认为H3H3可以作为单倍型标记用于分子标记辅助选择2.PGLYRP2基因多态性及其与SCS、产奶性状关联分析在PGLYRP2基因全长序列共确认了5个SNP位点。单SNP位点关联分析表明C+4867T与SCS关联（P<0.05），同时所有位点均与乳脂率关联（P<0.01或P<0.05）。单倍型组合关联分析表明H2H2与较高乳脂率关联（P<0.05）。因此认为，PGLYRP2基因中SNP与SCS及乳脂率相关，而PGLYRP2基因影响乳脂率的机制需要进一步研究。3.PGLYRP3、PGLYRP4基因多态性及其与SCS、产奶性状关联分析在PGLYRP3、PGLYRP45个位点SNP与SCS、产奶性状之间关联分析表明PGLYRP3中仅P3-T870C与平均日产奶量相关（P<0.05），其他位点与各性状均不相关，而PGLYRP4基因中P4-A536G位点与SCS、乳脂率和乳蛋白率均相关（P<0.01或P<0.05），而P4-T585C与各性状均不相关。PGLYRP4基因单倍型组合与SCS和乳脂率相关（P<0.05）。因此，PGLYRP4基因中P4-A536G位点是重要的SNP位点，具有作为分子标记用于分子辅助育种的潜力。4.PGLYRP1基因克隆、序列分析、真核表达及抗菌活性检测以血液来源cDNA扩增PGLYRP1基因，以pPIC9K构建pPIC9K-PGLYRP1重组表达载体并电转化酵母GS115菌株，Tricine-SDS-PAGE检测确认PGLYRP1蛋白以可溶形式表达，经大量表达和纯化获得了浓度为0.3mg/mL的PGLYRP1，抑菌试验表明，PGLYRP1对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌有较好抑菌作用，对停乳链球菌抑菌作用较弱，对沙门氏菌、大肠杆菌无效。5.PGLYRP2、PGLYRP3S、PGLYRP3L和PGLYRP4基因克隆、序列分析与真核表达成功以肝脏来源cDNA扩增PGLYRP2，以食道来源cDNA扩增PGLYRP3与PGLYRP4，检测到PGLYRP3存在两种不同长度的可变剪切体PGLYRP3S（短型）和PGLYRP3L（长型），对PGLYRP2、PGLYRP3S、PGLYRP3L和PGLYRP44种蛋白分别与pPIC9K、pGAPZαA、pPICZαA3种载体共构建了12个重组表达载体并转化到GS115、KM71、X33，但均未检出到目的蛋白表达。因此认为PGLYRP2、PGLYRP3S、PGLYRP3L和PGLYRP4可能不适于酵母真核表达。6.PGLYRP2、PGLYRP3S、PGLYRP3L和PGLYRP原核表达以大肠杆菌原核表达载体Pet22b、Pet31b、pet43.1b分别构建了PGLYRP2、PGLYRP3S、PGLYRP3L和PGLYRP4共12个重组原核表达载体，以Pet32a构建了PGLYRP2原核表达载体。各载体均转化到大肠杆菌Rosetta-gamiB（DE3）pLysS表达菌株，经过22℃诱导表达，4种肽聚糖识别蛋白在Pet22b和Pet31b重组表达菌株中全部为包涵体表达，无可溶表达，在Pet43.1b重组表达菌株中为较高比例可溶表达，PGLYRP2在Pet32a重组表达菌株中为极少量可溶表达，多数为包涵体。对Pet43.1b重组表达的上述4种蛋白以镍离子金属鳌合亲和层析介质纯化表明4种蛋白均未成功纯化，其原因可能是Nus标签过大，使重组蛋白两个His标签被折叠到蛋白内部。7.六个溶菌酶亚型基因克隆、真核表达与抗菌活性检测以pPIC9K表达载体和酵母GS115菌株成功克隆并表达了LYZ3、LYZ2、LYZ14D、LYSB、LYZ5个溶菌酶亚型，但LYSB表达水平极低，对纯化成功的LYZ3、LYZ2、LYZ14D、LYZ溶菌酶抑菌试验表明，胃来源的LYZ3与LYZ2具有较高的抑菌活性，而LYZ14D与LYZ抑菌活性较弱。在相同浓度0.25mg/mL条件下LYZ3与LYZ2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用较强，而对沙门氏菌、无乳链球菌和停乳链球菌未表现出抑菌活性。LYZ14D与LYZ对五种致病菌未表现出抑菌活性，表明胃来源的LYZ3与LYZ2具有作为药物用于乳房炎治疗的潜力。
【作者】王洪亮；
【导师】刘小林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，遗传学，2014，博士
【关键词】牛；肽聚糖识别蛋白；溶菌酶；SNP；克隆表达；致病菌；

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