小麦抗条锈病基因Yr10及防卫相关基因TaMDHAR4的功能分析

【摘要】由条形柄锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）引起的小麦条锈病是危害小麦最为严重的病害之一，在世界上主要产麦国家和地区普遍发生，尤其是在冷凉潮湿和高海拔地区，其发生更为严重。国内外大量研究结果和诸多生产实践证明，合理选育并利用小麦抗锈品种是控制条锈病最为经济、安全、有效的方法。小麦抗锈资源的不断挖掘和合理利用，俨然成为植保工作者和抗病育种研究人员面临的长期课题，而小麦抗锈性机制研究则是亟需解决的重要问题。因此，研究小麦抗条锈病基因及防卫相关基因的功能，不仅可以加深小麦与条锈菌互作的认识，还可以丰富小麦的抗条锈病基因资源，对抗锈品种的合理利用及遗传改良和条锈病的持久控制具有重要作用。为此，本研究首先对BSMV-VIGS体系进行优化和探索，以期借助该体系对小麦抗条锈病基因Yr10及防卫相关基因TaMDHAR4进行功能解析。在实验室前期利用图谱克隆分离出候选基因Yr10的基因组序列4B及其假基因4E的基础上，利用生物信息学对候选Yr10（4B）及其假基因4E核苷酸和编码蛋白的结构分析及其启动子的特征进行描述，初步预测该候选基因的功能，进而运用转基因方法及病毒诱导基因沉默技术对候选Yr10进行功能分析，明确该候选基因为Yr10；同时，借助于实验室已获得的小麦“水源11”与条锈菌互作的转录组数据筛选出目标基因单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbatereductase,MDHAR），采用电子克隆和RT-PCR技术获得该基因完整的ORF，并对其核苷酸和编码蛋白的结构特征进行生物信息学分析，并在mRNA水平对其表达特征进行描述。通过以上研究，为揭示这两类基因在小麦与条锈菌互作中的功能研究奠定理论基础。此外，本文深入系统地研究了BSMV-VIGS体系在小麦中的应用，为该技术的推广和应用提供了保障。具体研究内容和结果如下：1.以PDS为指示基因，优化了BSMV-VIGS在小麦中的应用。明确了插入片段的大小、方向对BSMV-VIGS的影响。与插入片段为189bp、476bp相比，携带316bp的病毒载体诱导小麦的沉默效果最好，正反向片段插入方式在诱导小麦PDS沉默时并无显著差异，反向插入片段效果略好，而正反双向同时插入PDS基因片段较前两者诱导效果更好。对PDS沉默后转录水平分析，接种后第10d沉默效率最高，在14dpi～18dpi还有一次下调后，随即上调表达，在转录水平上沉默渐渐消失。PDS基因沉默可至少持续三周以上。此外，借助BSMV-VIGS载体，在小麦穗部和未成熟的籽粒成功实现了PDS基因有效沉默，为BSMV-VIGS技术的推广奠定了基础。2.通过对候选序列4B（Yr10）与其假基因4E进行生物信息学分析，表明二者均属于NBS-LRR类基因，且相似性高达84%，但由于4E启动子的调节元件TSS位点、TATA-box及CAAT-box的缺失导致其不能正常翻译蛋白，从而丧失功能。与小麦其它类CC-NBS-LRR类蛋白相比，发现Yr10编码的蛋白序列较为特异，与相似度最高的Lr10一致性仅为40%。与其它非条锈菌寄主植物（山羊草、簇毛麦，二穗短柄草、水稻和高粱等）从基因组水平进行分析表明，Yr10编码的蛋白高度保守，且内含子都定位于kinase-2a,推测其与进化相关。利用正向转基因技术，将Yr10转入小麦感病品种Fielder中，Fielder对条锈菌SRC-84的亲和性丧失而表现为具有HR反应的非亲和性。借助反向的病毒诱导基因沉默技术研究发现，Yr10基因在小麦品种Moro中沉默后，该品种对条锈菌SRC-84的抗病性降低，变为感病，同时基因沉默后的表达特性及条锈菌侵染组织学的结果进一步验证了Yr10沉默的表型变化。以上结果表明，Yr10基因在小麦品种“Moro”对条锈菌对的抗病性中起主导作用。3.克隆了小麦单脱氢抗坏血酸还原酶基因TaMDHAR4，该基因ORF全长为1431bp。编码477个氨基酸，其编码的蛋白包含1个信号肽，2个跨膜区域，推测该蛋白为膜蛋白。经同源性分析，TaMDHAR4蛋白与二穗短柄草、水稻和玉米同源性最高，与已知的拟南芥6个MDHAR蛋白中AtMDHAR4相似度最高。在小麦与条锈菌的非亲和与亲和互作中，该基因在非亲和互作中12hpi和18hpi的表达量明显下调，但在亲和组合中，该基因的转录水平并无明显变化。TaMDHAR4在小麦与条锈菌的亲和与非亲和互作中，最大表达量均在接种后48h；施加外源激素（MeJA，ABA和ET）都会诱导TaMDHAR4表达量的升高，而Gas、SA和BA对该基因的转录水平并无明显影响；通过对条锈菌侵染的小麦喷施SOD和APX，qRT-PCR结合H2O2的细胞化学定位，研究发现高浓度的H2O2条件下TaMDHAR4下调表达，而低浓度的H2O2伴随着TaMDHAR4上调表达。借助BSMV-VIGS体系，研究发现TaMDHAR4沉默后小麦的HR反应增强，同时条锈菌菌丝的生长受到抑制。以上结果表明，TaMDHAR4参与了小麦的HR反应，并通过平衡活性氧的正常代谢而在小麦与条锈菌互作中发挥重要作用。
【作者】刘巍；
【导师】康振生；
【作者基本信息】西北农林科技大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】小麦；条锈菌；BSMV-VIGS；Yr10；TaMDHAR4；

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