一.干扰素释放试验对于结核性脑膜炎的诊断价值以及诊断模型的建立 二.结核性脑膜炎差异miRNA的初步筛选

【摘要】TB目前仍然是严重威胁人类生命的最主要感染性疾病，中国2010年全国结核病流行病学调查显示肺结核病例约500万，每年新发病例达100万。结核性脑膜炎（tuberculousmeningitis，TBM）的发病率虽然仅占结核病的1%-2%，但是其死亡率和致残率却高于40%，高死亡率主要是缺乏敏感特异的诊断手段所致。因此，寻找一种新的敏感特异的诊断方法，提高TBM的诊断水平，是降低TBM死亡率和致残率的关键。γ-干扰素释放试验（interferongammareleasingassay，IGRAs）根据特异性抗原刺激后机体效应T淋巴细胞产生的γ-干扰素来判断诊断结核感染的免疫学方法，由于不能区分结核潜伏感染（latenttuberculosisinfection，LTBI）和活动性结核病（activetuberculosis，ATB），而致其在TB高负担国家诊断价值受限。结核分枝杆菌（MycobacteriumTuberculosis，M.TB）感染部位具有隔室化的特点，即抗原特异性T淋巴细胞被募集到局部感染部位，感染部位如脑脊液（cerebrospinalfluid，CSF）的T-SPOT.TB有可能获得比外周血（peripheralblood，PB)T-SPOT.TB更高的诊断准确性。目前我国尚没有CSFT-SPOT.TB检测诊断TBM的相关数据。ThwaitesGE等2002年通过五种临床特征建立了预测TBM的越南模型。模型包含五项内容：年龄、病程、血常规白细胞计数、CSF白细胞计数和CSF中性粒细胞比例。越南模型主要是鉴别TBM和细菌性脑膜炎，而在我国细菌性脑膜炎发病率相对较低，因此这一模型并不一定符合我国脑膜炎的发病现状，还需要建立适合我国的一种新的诊断模型。由于PBT-SPOT.TB和CSFT-SPOT.TB可能具有较高的诊断准确性，将这两项指标以及其他临床检测指标联合，建立诊断模型，有可能获得较好的诊断准确性。本课题最终纳入TBM31例和non-TBM40例进行PBT-SPOT.TB和CSFT-SPOT.TB，两种检测的敏感性分别为93.6%（29/31,95%CI：79.3%-98.2%）和53.3%（16/30，95%CI：36.1%-70.0%），特异性分别为75.0%（30/40，95%CI：59.8%-85.8%）和94.8%（37/39，95%CI：83.1%-98.6%），诊断准确性分别为83.7%（59/71,72.7%-90.1%）和76.8%（53/69，95%CI：65.6%-85.2%）。PBT-SPOT诊断的敏感性高于CSFT-SPOT.TB，而CSFT-SPOT.TB的特异性高于PBT-SPOT.TB。将这两项指标和TBM、non-TBM之间存在差异的CSF蛋白、CSF腺苷脱氨酶和发病时间等共五项指标输入支持向量机（SVM），优选出的最具诊断意义的是PBT-SPOT.TB和CSFT-SPOT.TB，用这两项指标确立决策树、建立联合诊断模型，得到联合诊断模型的敏感性和特异性分别为90.0%（27/30，95%CI：27/30）和94.9%（37/39，95%CI：83.1%-98.6%），其诊断准确性为92.8%（64/69，95%CI：84.8%-96.9%），高于PBT-SPOT.TB的和CSFT-SPOT.TB。而从本课题纳入的病例分析，越南模型验证的特异性仅为5%。本研究表明PBT-SPOT.TB由于敏感性较高，有可能作为排除TBM诊断的一种方法，CSFT-SPOT.TB由于特异性较高，有可能作为目前纳入TBM诊断的一种方法。越南模型并不适用于我国TBM的诊断和鉴别诊断，而根据PBT-SPOT.TB和CSFT-SPOT.TB建立的联合诊断模型对于结核性脑膜炎的诊断具有较高的诊断价值，但是无论单一的PBT-SPOT.TB和CSFT-SPOT.TB检测，或及联合诊断模型的意义，都需要进一步进行大样本前瞻性实验加以验证。miRNA是近年来生命科学研究的热点，某些miRNA或可作为肿瘤、自身免疫性疾病诊断的生物标识。然而，miRNA作为生物标识在细菌感染性疾病尤其是TB中的研究相对较少。由于这种小分子在细胞的生长、分化、凋亡、代谢以及病毒感染、肿瘤的发生等生理病理过程中具有重要作用，因此推测其在TBM发病的免疫学机制、疾病的进展等方面也可能具有一定的意义，有可能做为TBM诊断的生物标识。诊断手段的缺乏是导致TBM的死亡率多年来高居不下的首要原因，如果找到特异表达的miRNA，则可以提高TBM的诊断水平。本研究入选TBM组8例，non-TBM（病毒性脑膜炎）组8例和健康对照6例，应用Agilent芯片筛选得到11种差异miRNA，具体为hsa-miR-126-3p/5p，hsa-miR-130a-3p，hsa-miR-151a-3p/5p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-4291，hsa-miR-584-5p，hsa-miR-6127，hsa-miR-744-5p。通过靶基因预测和GO分析发现上述差异miRNA的靶基因的功能主要是参与转录过程、DNA与RNA的代谢过程等；Pathway通路分析显示miRNA的靶基因主要是参与肿瘤通路、MAPK信号通路、Wnt通路等。今后的工作中将进一步筛选病例扩大样本量进行RT-PCR验证，以确定差异miRNA是否具有诊断TBM的意义，同时要进一步的研究以证实这些差异miRNA是否与炎症反应以及TB、TBM发病的免疫机制相关。
【作者】刘菲；
【导师】张宗德；
【作者基本信息】北京市结核病胸部肿瘤研究所，免疫学，2014，博士
【关键词】结核性脑膜炎；脑脊液；γ-干扰素释放试验；诊断模型；miRNA；芯片；

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