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调节NMD通路中SMG5的miR-433的鉴定及miRNA-NMD-作用底物调控通路的初步研究
【摘要】在真核细胞的进化过程中形成许多mRNA质量监控机制来实现基因的准确表达,其中无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是一种重要的转录后监控机制,可识别含提前终止密码子(prematureterminationcodons,PTC)的异常mRNA并对其进行降解,有效避免产生的截短蛋白对细胞的毒害。其中,SMG5在NMD中扮演着重要的角色,SMG5是一个编码蛋白基因,没有核糖核酸酶活性,但对逆转录酶的活性有促进作用,它和SMG7一起被认为与涉及核酸外切途径的mRNA降解机制存在联系—通过招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脱磷酸化。microRNA(miRNA)是一类长度约为19-24nt内源性保守单链非编码小分子RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3’UTR特异互补结合,在转录后水平上调节靶mRNA的表达或者阻止蛋白的翻译,目前研究表明,miRNA参与了许多生理及病理的过程,例如,参与了肿瘤的发生发展和转移、细胞凋亡、细胞增殖和分化的生物化学过程等。但是目前有关miRNA参与NMD通路的报道比较少,因此,作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介导mRNA的降解是一个值得研究的课题,本试验以NMD通路中的关键因子SMG5为研究对象,通过生物信息学的方法筛选出潜在的以SMG5为靶基因的miR-433。并利用分子生物学方法研究二者的作用关系,以及在NMD通路中所发挥的作用。主要的研究结果如下：(1)生物信息学预测潜在调控SMG5的miRNAs。利用生物信息学软件TargetScan等对作用于SMG53’UTR的miRNA进行预测,结果得到了多个miRNAs,经过筛选最终确定miR-433作为研究对象。(2)组织表达谱的构建。利用实时定量PCR技术检测miR-433和SMG5在小鼠心、肝、肾等十二种组织的表达量,并绘制了组织表达谱。结果显示：SMG5基因在小鼠组织中广泛表达,miR-433在脑和肌肉中表达量较高。(3)双荧光素酶报告基因的检测。根据miR-433与SMG5基因的3’UTR结合序列,构建了野生型和突变型荧光素酶报告基因pmirGLO载体。并将这两种质粒分别与miR-433mimic和miR-433inhibitor共转入HEK-293T细胞、Hela细胞,检测相应的荧光活性,结果表明：miR-433与SMG5之间存在负调控的关系。(4)miR-433调控SMG5的表达检测。miR-433mimic转染BHK细胞后,利用RT-PCR和Westernblot检测SMG5的表达量,结果发现：SMG5的mRNA表达量显著下降(P<O.01),miR-433也降低了SMG5蛋白水平；而将miR-433inhibitor转染C2C12细胞后,得到的结果刚好相反,SMG5的表达量显著上升(P<O.01),miR-433inhibitor上调了SMG5的蛋白水平。(5)利用荧光定量PCR和westernbolt检测miR-433调控SMG5底物基因GADD45B.TBL2的表达。将miR-433mimic转染细胞后,利用荧光定量PCR和westernbolt检测NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表达,结果显示：miR-433上调了TBL2、GADD45B的表达,进一步推断miR-433参与NMD通路。(6)干扰SMG5对底物基因的影响。利用SMG5基因的siRNA,转染C2C12细胞,实时荧光定量PCR检测SMG5被干扰后底物基因TBL2、GADD45B的表达量,结果显示：干扰24h后,SMG5表达量较对照组显著下降(P<0.01),而TBL2、GADD45B则有不同程度的上升(P>0.05)；进行Westernbolt试验,所得的结果与此相符。从以上结果,我们推断miR-433能够通过抑制SMG5的表达参与NMD通路。
【作者】张芳；
【导师】任竹青；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】无义介导的mRNA降解；SMG5；miRNA-433；GADD45B；TBL2；

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兔短链脂肪酸受体GPR41和GPR43基因的鉴定
【摘要】短链脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,主要由肠道微生物发酵没有被消化和不能被消化的碳水化合物生成。短链脂肪酸不仅是动物体内重要的能量来源(可提供牛60%-70%的能量需要,猪15%-24%的能量需要),而且是重要的信号分子,在很多生理过程中发挥重要的调节作用。2003年,有研究表明短链脂肪酸能够激活G蛋白偶联受体GPR41和GPR43,并且GPR41和GPR43与短链脂肪酸结合对机体代谢、免疫等功能具有潜在的调控作用。迄今,关于GPR41和GPR43的研究主要集中在人、大鼠和小鼠上,对于兔基因组中是否含有GPR41和GPR43基因及其结构、功能和组织表达情况尚未有研究报道。本研究,首先确定兔全基因组中是否含有与人和啮齿类动物GPR41和GPR43基因序列相似的基因。然后检测GPR41和GPR43基因是否在兔的各个组织中表达。若表达,通过巢式PCR法和蛋白印迹法分别在基因水平和蛋白水平检测兔各组织中GPR41和GPR43的表达情况。1利用BLAST和DNAMAN等进行序列分析运用BLAST对比兔的基因组与人、大鼠、小鼠、牛和山羊的GPR41基因和GPR43基因。结果表明：兔的基因组含有GPR41和GPR43基因,且兔GPR41基因序列与人大鼠、小鼠、牛、和羊的GPR41基因序列的相似性分别为84%、80%、81%、84%和84%；兔GPR43基因序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43基因序列的相似性分别为83%、85%、84%、79%和81%。氨基酸序列对比,结果表明：GPR41氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR41氨基酸序列的相似性分别为70%、75%、75%、74%和74%；GPR43氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、牛和羊的GPR43氨基酸序列的相似性分别为79%、81%、82%、72%和73%。2巢式PCR检测兔各组织中GPR41和GPR43mRNA的表达采用巢式PCR技术,分别分析GPR41和GPR43基因在兔不同组织内]mRNA水平。结果表明：GPR41基因在除了下丘脑和垂体外的各组织中都有表达,在肝脏、结肠和脂肪组织中表达量较高；肌肉和心脏组织表达量较少。GPR43基因在各组织中均有表达,在下丘脑和脂肪组织中表达量较高；肌肉和肾上腺组织表达量较少。3蛋白印迹法检测兔各组织中GPR41和GPR43蛋白表达水平利用western-blot技术,分别检测兔不同组织中GPR41和GPR43蛋白的表达水平。结果表明：GPR41在除了下丘脑和垂体组织外的其他组织中均有表达,在肝脏组织中表达量较高,实验检测出的蛋白大小在55kD-70kD之间,大于GPR41目的蛋白39kD;GPR43在兔的组织中均有表达,在肌肉和肺组织中表达量较高,实验检测出的蛋白大小在55kD-70kD,大于GPR43目的蛋白43kD。
【作者】苏浩；
【导师】姚文；
【作者基本信息】南京农业大学，养殖，2013，硕士
【关键词】兔；GPR41；GPR43；mRNA表达；蛋白表达；

【参考文献】
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加权基因共表达网络分析（WGCNA）在食管鳞癌中的应用
【摘要】食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是我国常见的恶性肿瘤,其五年生存率不到25%,复发和转移是导致ESCC病人死亡和预后不良的主要原因。ESCC的发生发展是一个多基因参与、多因素作用、多阶段进展的复杂的生物学过程,它依赖于多种基因、转录本、蛋白质的相互作用及调控。深入研究ESCC的分子机制是提高ESCC诊治效果的基础。传统的生物学研究以单个基因、转录本和蛋白质的具体功能及特点为基础,尽管这种研究方法对在分子水平上揭示生命机制起着重要的作用,但不可否认其仅能对生物系统的局部作出解释,无法对生物系统的整体行为进行更为深入和全面的探索。生物网络可直观地展现生物系统中各个功能元件之间的相互关系,为研究生物体在系统水平的特征提供了重要的平台。加权基因共表达网络分析(Weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA)利用了系统生物学的思想寻找基因之间表达的相似性,并将表达高度相关的基因确定为一个基因模块。本研究将WGCNA用于ESCC表达谱数据的分析。我们使用ESCC肿瘤组织与癌旁正常组织中差异表达的基因作为WGCNA的数据源进行分析,共得到8个与上皮细胞分化、细胞外基质重构、细胞周期等GO分类密切相关的基因模块。接着,我们选择一个独立队列的ESCC表达谱数据来验证WGCNA分析得到的基因模块,发现大多数的模块在不同数据来源的ESCC队列中具有一致性,这结果表明我们的分析方法准确且具有可重复性。最后我们联合分析基因模块与临床信息,找到一系列与肿瘤分级、病人生存时间、肿瘤分期等相关的基因模块。加权通过进一步分析基因模块结构,我们得到一系列与肿瘤分级高度相关且在模块中具有高连接度的枢纽基因,这些基因对ESCC的发生发展具有潜在的重要作用。我们的结果表明WGCNA能够发现具有生物学意义的基因模块,且通过联合临床信息分析所发现的枢纽基因也与文献报道基本吻合,这也证明WGCNA分析基因芯片数据的准确性和有效性。这是WGCNA方法第一次被用于分析ESCC数据,对基因模块信息的进一步挖掘有助于我们更深入地研究关键基因、关键信号通路、基因之间的调控机制对于肿瘤发生发展的作用和意义。
【作者】王攀；
【导师】赫捷；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】食管鳞癌；基因共表达网络；肿瘤分级；加权基因共表达网络分析；

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